摘要：微型化樣品前處理具有許多優(yōu)勢。較少的溶劑用量可以降低溶劑成本，減少 浪費(fèi)。較少的樣品量使其易于在實(shí)驗(yàn)室中取用、儲(chǔ)存和處理。樣品量的減少 可以節(jié)約樣品前處理吸附劑的成本，大幅降低使用標(biāo)記化合物作為內(nèi)標(biāo)的成 本。樣品量較小時(shí)可以對(duì)復(fù)雜的分析物使用更多標(biāo)記化合物，但如果樣品量 較大，這樣做會(huì)產(chǎn)生高昂成本。 我們使用微型化 QuEChERS 萃取和 Agilent 7010三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的超高 效離子源分析食品中的農(nóng)藥，可將進(jìn)樣量減少 75%。對(duì)蘋果、胡蘿卜和西蘭 花中的 126 種農(nóng)藥進(jìn)行了研究，其中 95% 農(nóng)藥的平均定量限 (LOQ) ~ 10 ng/g。 基質(zhì)進(jìn)樣量低可延長正常運(yùn)行時(shí)間，維持高性能，從而降低維護(hù)成本。我們 僅使用標(biāo)準(zhǔn) 2 µL 進(jìn)樣量的 25% 并采用推薦的農(nóng)藥分析方法，分析了濃度小 于等于 EPA、EU 和日本 MRL 閾值 0.01 mg/kg (10 ng/g) 的農(nóng)藥，此濃度適用于 監(jiān)測暴露。

前言：用于農(nóng)藥分析的快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用和安全 (QuEChERS) 方法由 USDA 于 2003 年提出 [1]。后來這 種方法經(jīng)過改進(jìn)，加入緩沖萃取系統(tǒng) [2]，可以分析較為 棘手的農(nóng)藥。AOAC 2007.01 [3] 和 EN 15662 [4] 中規(guī)范并采 納了這兩種改進(jìn)方法。概括而言，這種方法采用單步緩 沖乙腈萃取，同時(shí)用硫酸mei (MgSO4) 從樣品中鹽析出水 以誘導(dǎo)液-液分配。凈化采用分散式固相萃取法（分散式 SPE），同時(shí)使用吸附劑和 MgSO4。 我們分析了蘋果、胡蘿卜和西蘭花，因?yàn)樗鼈兪敲绹r(nóng) 業(yè)部 (USDA) 農(nóng)產(chǎn)品銷售局根據(jù)農(nóng)藥數(shù)據(jù)項(xiàng)目 (PDP) [5] 規(guī) 定的收獲測試期間的農(nóng)產(chǎn)品。EPA、EU 和日本均已制定 最大殘留* (MRL)，此*是確定食品中農(nóng)藥最大允 許濃度的安全限值。這些 MRL 能夠防止非法或過量使用 農(nóng)藥，從而保護(hù)消費(fèi)者的身體健康與環(huán)境。因此，相關(guān) 機(jī)構(gòu)會(huì)對(duì)可能影響消費(fèi)者安全以及破壞環(huán)境的農(nóng)藥進(jìn)行 持續(xù)監(jiān)測，以確保產(chǎn)品的安全性和法規(guī)依從性 [6]。 許多食品的成分或加工方式使其變得非常復(fù)雜，這些食 品中可能存在大量的干擾化合物，導(dǎo)致背景干擾增加。 GC/MS/MS 經(jīng)常用于對(duì)此類復(fù)雜基質(zhì)中的痕量目標(biāo)化合 物進(jìn)行篩查、確認(rèn)與定量分析。串聯(lián)質(zhì)譜可以實(shí)現(xiàn)選擇 性離子對(duì)監(jiān)測，因此可以消除或最大限度降低背景干擾。 QuEChERS 樣品前處理方法從這些復(fù)雜基質(zhì)中萃取化合 物，但不會(huì)*去除所有干擾基質(zhì)。因此需要其他技術(shù) 輔助除去分析系統(tǒng)中的污染物。例如，氣相色譜柱的反 吹功能可以確?；|(zhì)中的高沸點(diǎn)化合物不會(huì)流經(jīng)色譜柱， 減少色譜柱流失。反吹功能還可以消除鬼峰，將質(zhì)譜儀 的污染降至低 [7,8]。改善離子源內(nèi)離子化（超高效離 子化）等其他技術(shù)，可以在更低的進(jìn)樣量下保持對(duì)目標(biāo) 分析物的高靈敏度。

QuEChERS 方法基于 10 或 15 g 的均質(zhì)代表性食品樣品。 改用較小樣品量具有眾多優(yōu)勢，表現(xiàn)在樣品更便于處理、 溶劑和標(biāo)記標(biāo)樣用量減少，以及需要的儲(chǔ)存空間更少。 在本應(yīng)用簡報(bào)中，我們研究了按比例減量的 QuEChERS 萃取方法。樣品、溶劑和鹽可以按比例減少，同時(shí)保持 樣品/溶劑/鹽的比例與經(jīng)過驗(yàn)證的 QuEChERS 方法中規(guī) 定的相同 [3,4]。因此，我們預(yù)期回收率或分析結(jié)果不會(huì) 受到負(fù)面影響。微型化 QuEChERS 方法與 Agilent 7010 三 重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的超高效離子源相結(jié)合，可大大 減少達(dá)到推薦檢測限 (LOD) 和減少基質(zhì)效應(yīng)所需的進(jìn)樣 量，并降低樣品前處理成本。

實(shí)驗(yàn)部分 所有試劑和溶劑均為分析純級(jí)或更高等級(jí)。乙腈 (ACN) 購自 Honeywell International, Inc. (Muskegon, MI, USA)，乙酸 購自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO, USA)。純度 > 95% 的 L-古洛糖酸、g-內(nèi)酯、L-古洛糖酸內(nèi)酯和 D-山梨醇同樣 購自 Sigma-Aldrich 公司。定制農(nóng)藥組合（15 種*混合 物）的 100 µg/mL 丙酮溶液購自 AccuStandard 公司 (New Haven, CT, USA)。磷酸三苯酯 (TPP)和 13C12- p,p-DDT 購自 Sigma-Aldrich 公司和 Cerilliant 公司 (Round Rock, TX)。 向 500 mL ACN 中加入 5 mL 乙酸 (HAc)，制成 1% 乙酸的 乙腈溶液。L-古洛糖酸內(nèi)酯、D-山梨糖醇儲(chǔ)備液以及分 析物保護(hù)劑的配制方法見“安捷倫 GC/MS/MS 農(nóng)藥殘留 分析參考指南”第 87 頁。請(qǐng)聯(lián)系安捷倫客戶服務(wù)中心索 取指南印刷本 [9]。 儀器 本研究使用 Agilent 7890 氣相色譜聯(lián)用帶超高效離子源的 7010 三重四極桿質(zhì)譜儀。氣相色譜系統(tǒng)配備電子氣路控 制 (EPC)、支持風(fēng)冷的多模式進(jìn)樣口 (MMI)、Agilent 7693A 自動(dòng)液體進(jìn)樣器，以及基于 Ultimate 吹掃接頭（由 AUX EPC 模塊控制）的反吹系統(tǒng) [7,8]。使用 Agilent MassHunter 軟件進(jìn)行儀器控制以及定性和定量數(shù)據(jù)分析。

安捷倫惰性流路組件 色譜柱： Agilent J&W HP-5ms 超高惰性色譜柱, 5 m × 0.25 mm, 0.25 µm（部件號(hào) G3903-61005）和 15 m × 0.25 mm, 0.25 µm（部件號(hào) 19091S-431UI） 襯管： 超高惰性淺凹坑襯管，2 mm（部件號(hào) 5190-2297） 密封墊圈： UltiMetal Plus 可塑金屬密封墊圈（部件號(hào) G3188- 27501），安裝在用于色譜柱反吹的 Ultimate 吹掃接 頭上 其他安捷倫備件 樣品萃?。?Agilent Bond Elut QuEChERS AOAC 萃取鹽包（部件 號(hào) 5982-6755）；用于一般水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散式固相萃取試劑盒（部件號(hào) 5982-5022）以及用于深色素水果和蔬菜的 EN 分散 式固相萃取試劑盒（部件號(hào) 5982-5221） 均質(zhì)子： 用于 15 mL 試管的 Bond Elut QuEChERS 陶瓷均質(zhì)子 （部件號(hào) 5982-9312） 進(jìn)樣針： 手動(dòng)進(jìn)樣針，10 µL（部件號(hào) 5190-1491）、25 µL （部件號(hào) 5190-1504）、100 µL（部件號(hào) 5190-1518）、 250 µL（部件號(hào) 5190-1525） 樣品瓶： 自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶（部件號(hào) 5182-0733） 樣品瓶內(nèi)插管： 自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶內(nèi)插管，脫活玻璃，平底（部件 號(hào) 5183-2086）

其他設(shè)備 • Robot Coupe 攪拌機(jī) • VWR 渦旋振蕩器 • Heraeus Labofuge 400 離心管 • Eppendorf 微量離心管 樣品前處理 使用安捷倫萃取鹽和分散試劑盒，根據(jù) QuEChERS 方法 的 AOAC 版本 [3] 對(duì)水果和蔬菜萃取液進(jìn)行前處理。將有 機(jī)培植的農(nóng)產(chǎn)品切碎、冷凍，隨后在 Robot Coupe 攪拌機(jī) 中利用干冰進(jìn)行均質(zhì)化。將均質(zhì)樣品儲(chǔ)存于 –20 °C 下等 待萃取。 萃取/分離 稱取 2 g 均質(zhì)樣品至 15 mL 離心管中，加入兩粒陶瓷均 質(zhì)子。向 QC 樣品中加入 1 µg/mL 農(nóng)藥儲(chǔ)備液（126 種農(nóng) 藥），得到濃度為 5、10 和 50 ng/g 的 QC 樣品。除對(duì) 照空白外，向其余所有樣品中加入 10 µL 內(nèi)標(biāo)加標(biāo)溶液 （10 µg/mL d10、13C12-p,p-DDT 和 TPP），使每個(gè)樣 品的濃度均為 50 ng/g。蓋上離心管，渦旋混合 1 分鐘。 向每個(gè)管中加入 2 mL 1% HAc 的 ACN 溶液。蓋上離心管， 渦旋混合 1 分鐘。然后向管中直接加入 1 g Bond ElutQuEChERS AOAC 鹽（部件號(hào) 5982-6755）。將樣品管蓋緊， 用手劇烈振搖 1 分鐘。最后將樣品離心管在 4000 rpm 的 轉(zhuǎn)速下離心 5 min。

分散式固相萃取凈化 從萃取物中移取1 mL 上層ACN 相至2 mL Bond Elut QuEChERS 分散式固相萃取管中。對(duì)于蘋果萃取液，使用含有 50 mg PSA 和 150 mg MgSO4 的 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散式 固相萃取試劑盒。對(duì)于西蘭花和胡蘿卜萃取液，使用含 有 25 mg PSA、2.5 mg GCB 和 150 mg MgSO4 的 Bond Elut QuEChERS EN 分散式固相萃取試劑盒。將管蓋緊，渦旋 混合 1 分鐘，然后在微量離心管中以 13000 rpm 的速率離 心 3 分鐘。移取 250 µL 萃取液至 2 mL 自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶 的 400 µL 脫活玻璃平底內(nèi)插管中。再向內(nèi)插管加入 50 µL 1% HAc 的 ACN 溶液（如為萃取后加標(biāo)，則加入該混合 溶液）和 10 µL AP（分析物保護(hù)劑）[9]。圖 1 展示了微 型化 QuEChERS 樣品萃取步驟的工作流程。

儀器條件 氣相色譜條件 色譜柱 1： Agilent J&W HP-5ms UI, 5 m × 250 µm, 0.25 µm， 連接 MMI 和輔助 EPC 色譜柱 2： Agilent J&W HP-5ms UI, 15 m x 250 µm, 0.25 µm， 連接輔助 EPC 和真空系統(tǒng) 載氣： 氦氣 進(jìn)樣模式： 溶劑排空 進(jìn)樣量： 0.5 µL（進(jìn)樣針規(guī)格 5 µL) 溶劑清洗： 進(jìn)樣前，1x 溶劑 A，甲醇:水 (4 µL)，1x 溶劑 B， 乙腈 (4 µL) 進(jìn)樣后，7x 溶劑 A，甲醇:水，7x 溶劑 B， 乙腈（每次 4 µL） 樣品抽取次數(shù)： 5 進(jìn)樣速度： 快速 MMI 柱溫程序： 60 °C 保持 0.35 min，以 900 °C/min 升至 280 °C （保持 18 min），然后以 900 °C/min 升至 300 °C， 直到分析結(jié)束 分流出口吹掃流速： 50 mL/min，自 1.5 min 處開始 排空流速： 25 mL/min 排空壓力： 5 psi 持續(xù) 0.3 min 載氣節(jié)?。?關(guān)閉 隔墊吹掃流速： 3 mL/min 空氣冷卻（低溫）： 在 125 °C 處開啟（在 GC 中選擇 MMI 液氮選項(xiàng) 以進(jìn)行風(fēng)冷） 柱溫程序： 60 °C 保持 1.5 min，以 50 °C/min 升至 160 °C， 以 8 °C/min 升至 240 °C，以 50 °C/min 升至 280 °C（保持 2.5 min），以 100 °C/min 升至 290 °C（保持 1.6 min） 柱 1 流速程序： 0.897 mL/min 保持 15.2 min，從 100 mL/min 至 -1.706 mL/min（與色譜柱 2 的流量平衡， 以達(dá)到 2 psi 的進(jìn)樣口壓力），直到分析結(jié)束， 進(jìn)行色譜柱并行反吹，后運(yùn)行 -10.683 mL/min 柱 2 流速程序： 0.997 mL/min 直到分析結(jié)束， 后運(yùn)行 4 mL/min 保留時(shí)間鎖定： 甲基毒死蜱鎖定于 8.524 min 總運(yùn)行時(shí)間： 18.5 min 后運(yùn)行： 290 °C，0.5 min 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源： -70 eV 離子源溫度： 280 °C 四極桿溫度： 150 °C 傳輸線溫度： 280 °C 溶劑延遲： 4.0 min 氦氣淬滅氣： 2.25 mL/min 氮?dú)馀鲎矚猓?1.5 mL/min 采集模式： 多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) MS1/MS2 分辨率： 寬 時(shí)間段： 參考文獻(xiàn) [9] 第 94 頁 采集參數(shù)： 參考文獻(xiàn) [9] 第 95-105 頁

結(jié)果與討論：準(zhǔn)確校準(zhǔn) 本研究使用蘋果、胡蘿卜和西蘭花評(píng)估此方法在常規(guī)分 析中的使用。根據(jù)不同基質(zhì)選擇特定的分散式固相萃取 試劑盒；蘋果使用 PSA，胡蘿卜和西蘭花使用 PSA 和 2.5 mg GCB。圖 2 顯示了 126 種農(nóng)藥（濃度 10 ng/g）加標(biāo) 西蘭花基質(zhì)萃取物的代表性疊加譜圖。在空白基質(zhì)（蘋 果、胡蘿卜和西蘭花）萃取液中加入 1、5、10、20、 50 和 100 ng/g 的農(nóng)藥，制得含有 126 種農(nóng)藥和農(nóng)藥異構(gòu) 體混合物的校準(zhǔn)標(biāo)樣。將這六個(gè)標(biāo)樣的組合連續(xù)進(jìn)樣六 次，取六次的中位值繪制校準(zhǔn)曲線，采用 1/x 加權(quán)進(jìn)行 線性擬合。將其他五組標(biāo)樣用作 QC 樣品，在圖 3 中顯 示為藍(lán)色三角形，用于指示方法的精密度。根據(jù)校準(zhǔn)曲 線中每個(gè)濃度的含量計(jì)算值確定 RSD 百分比 (n = 6)。在 所有基質(zhì)中加入的 126 種農(nóng)藥中，95% 農(nóng)藥校準(zhǔn)數(shù)據(jù)組 的相關(guān)系數(shù) (R2) > 0.99。每進(jìn)樣一組六個(gè)濃度的校準(zhǔn)標(biāo)樣 后，進(jìn)樣一個(gè)溶劑空白。這些樣品中監(jiān)測到的棘手化合 物如圖 3 所示。 進(jìn)樣量為 0.5 µL 時(shí)，5 ng/g 標(biāo)樣中的分析物含量為 2.5 pg， 進(jìn)樣量為 2 µL 時(shí)這一含量為 10 pg。樣品量減少了 75%。 即使進(jìn)樣有所減少，某些最棘手農(nóng)藥仍在默認(rèn) MRL 的一 半或 5 ng/g 處得到最佳色譜圖。