前言：腺相關(guān)病毒 (AAVs) 是一類非常有應(yīng)用前景的新型生物療法，能夠治療許多罕見、棘手的遺傳病，例如脊髓性肌肉和遺傳性視網(wǎng)膜變性[1]。AAVs 是由蛋白質(zhì)衣殼和包裹 DNA 組成的大分子復(fù)合物，分別需要使用專用分析技術(shù)以確保整體產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。AAV 衣殼由三種不同的衣殼蛋白組成，通常以 VP1–3 表示，其化學(xué)計量比約為 1:1:10，每個衣殼共含 60 個蛋白質(zhì)拷貝[2]。美國食品藥品監(jiān)督管理局建議，在產(chǎn)品放行前需明確鑒定所有 AAV 治療藥物的病毒衣殼和包裹 DNA，特別是生產(chǎn)多種血清型或基因工程變異體的生產(chǎn)設(shè)施[3]。迄今為止，基于抗體的方法（例如 ELISA 和免疫印跡法）已成為常用的病毒衣殼分析技術(shù)。這些方法存在幾個弊端：基于抗體的方法不僅繁瑣且易于出錯，還要求針對分析的每種 AAV 類型生成高度特異性的抗體。這挑戰(zhàn)性，因為來自不同產(chǎn)品的 AAV 衣殼可能高度同源，例如，AAV 血清型 1 和 6 僅相差 6 個氨基酸（99% 同源），這使得它們很難通過抗體結(jié)合進行區(qū)分[4]。原則上，由于 LC/MS 直接測量蛋白質(zhì)質(zhì)量數(shù)，無需針對每種類型的 AAV 生成抗體，因此可實現(xiàn)快速且高特異性的病毒衣殼蛋白分析。然而，在以往的研究中，病毒衣殼蛋白的色譜分離結(jié)果相對較差[5]。這很成問題，因為共洗脫不僅會妨礙衣殼化學(xué)計量（AAV 感染性的重要決定因素）的準(zhǔn)確定量，還會影響信號強度和質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度[6]。

本應(yīng)用簡報介紹了一種優(yōu)化的 LC/FLDMS方法，用于快速分析 AAV 衣殼蛋白，確認(rèn) 7 種不同血清型的一級結(jié)構(gòu)。該方法具有簡單的樣品前處理要求，并可穩(wěn)定用于高鹽條件以及常用的非離子型清潔劑添加劑 Pluronic F-68。

實驗部分：AAV 樣品AAV 血清型 2、7、9、7m8、DJ、rh10和 Anc80 均購自 Vector Core @ GIS(A*STAR, Singapore)。AAV 樣品經(jīng)三次轉(zhuǎn)染在 HEK-293 細(xì)胞中表達，并通過分析型超速離心法進行了純化處理。在含有 0.001% Pluronic F-68 的磷酸鹽緩沖液中，樣品濃度約為 1.2 × 1010個病毒基因組/µL，收到樣品后即可使用，無需更換緩沖液。

樣品前處理每次分析都新鮮配制含有 12 mol/L 鹽酸胍 + 40 mmol/L DTT 的 200 mmol/L碳酸氫銨（pH  值約為 8.0）的變性緩沖液。將變性緩沖液以 1:3 的比例加入AAV 樣品中，使最終鹽酸胍的濃度達到3 mol/L。然后將樣品加熱到 70 °C 并保持 15 分鐘，確保其*變性。每次分析進樣 1.5 × 1011 個病毒基因組。LC/FLD-MS 用于完整衣殼蛋白分析使用以下儀器對樣品進行了分析：• Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)，包括：• Agilent 1290 Infinity II 高速泵(G7120A)• Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B)• Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B)

• Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器(G1321B)，配有 8 µL 流通池• Agilent 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF使用 A g i l e n t ZO R B A X R R H D 3 0 0 ?StableBond C18 (SB-C18) 和 SB-Diphenyl，2.1 × 100 mm, 1.8 µm 色譜柱（部件號858750-902 和 858750-944）進行分離。還使用 ZORBAX RRHD 300? SB-C3 色譜柱（部件號 858750-909）進行了方法開發(fā)，但不是優(yōu)化方法。選擇了由 0.1% TFA + 0.1% FA 的去離子水溶液 (mp A) 和 90% 異丙醇 + 9.8% 水 +0.1% TFA + 0.1% FA (mp B) 組成的高洗脫強度流動相。結(jié)合高溫，類似的流動相條件在 ZORBAX StableBond 色譜柱上實現(xiàn)了單克隆抗體分析的出色分離能力[7]。

由于芳香族殘留物的發(fā)射光譜可能會因溶劑暴露量和暴露程度的不同而有所差別，因此使用具有單激發(fā) (280 nm)/多發(fā)射（315、330、345 和 360 nm）模式的8 µL 流通池進行熒光檢測。結(jié)果顯示，360 nm 處的發(fā)射強度最高，因此使用該波長進行所有分析。所有數(shù)據(jù)分析均在Agilent BioConfirm 10.0 中進行。表 1、表 2 和表 3 列出了儀器和軟件設(shè)置。

LC/MS 肽譜分析將 10 µL 含有 6.0 × 1011 個病毒基因組的AAV 2（約 3.6 µg 蛋白質(zhì)）樣品變性，并在30 µL 含有 760 mg/mL 鹽酸胍 + 3.8 mg/mLTCEP 的 150 mmol/L Tris-HCl (pH 8) 中進行還原，并在 60 °C 下溫育 60 分鐘。冷卻至室溫后，加入 10 µL 133 mmol/L碘乙酰胺進行烷基化，并在室溫下避光溫育 30 min。然后使用 210 µL Tris-HCl稀釋樣品，并加入 0.2 µg Promega 測序級修飾型胰蛋白酶（貨號 V5117）。在 37 °C 下酶解 2 小時，然后再加入0.2 µg 胰蛋白酶，在 37 °C 下酶解過夜。第二天，加入 30 µL 10% 甲酸終止反應(yīng)，

然后使用 Agilent AssayMAP Bravo 系統(tǒng) (G5542A) 進行 C-18 凈化。在配備 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF的 1290 Infinity II 液相色譜儀上進行肽譜分析。使用 AdvanceBio 肽譜分析色譜柱（部件號 653750-902），2.1 × 150 mm,2.7 µm 進行分離。表 4 和表 5 列出了儀器設(shè)置。

結(jié)果與討論： LC/MS方法開發(fā)由于 AAV-2 的研究較為充分，因此使用該血清型進行了方法開發(fā)。衣殼蛋白VP1–3 的序列如圖 2 所示。所有衣殼蛋白均由 Cap 基因中的相同 DNA 序列轉(zhuǎn)錄得到，通過 mRNA 剪接和滲漏核糖體掃描機制形成三種高度同源的蛋白質(zhì)[6]。其中，這三種蛋白質(zhì)的 VP3 序列均相同，而 VP1 和 VP2 僅 N 端序列有所不同。