飲食是人體硒 (Se) 的主要來(lái)源，該必需元素的攝入主要取決于食品中的硒含量 和所消耗的食物量。由于許多國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品中硒的含量很低，所以硒缺乏成為了一 個(gè)值得注意的問(wèn)題。人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多提高人體硒攝入的食品添加策略；富硒 酵母就是人和動(dòng)物添加劑常用的硒來(lái)源之一。

評(píng)估硒是否充分不僅需要了解硒總含量，而且還要了解各種形態(tài)硒的含量。但 到目前為止，大部分研究都僅限于針對(duì)占總硒 12-20% 左右的水溶性酵母成分。 酵母的不溶性硒組分很多尚未被發(fā)現(xiàn)，表征這類主要組分的工作非常少，其中 Chassaigne 和 Chéry [1] 曾研究過(guò)酵母蛋白的硒特異性激光消融 (LA-) ICP-MS 指紋譜，Tastet 等人 [2] 曾用實(shí)驗(yàn)室自制的 nanoHPLCICP-MS 接口對(duì)富硒多肽進(jìn)行了硒選擇性檢測(cè)。在常規(guī)方法 中，通過(guò)測(cè)定總硒代蛋氨酸含量（含硒蛋白含量）來(lái)評(píng)估 富硒酵母的質(zhì)量。

本研究提出了一個(gè)安捷倫ICP-MS等離子體質(zhì)譜輔助的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用于 鑒定富硒酵母中的含硒蛋白。采用雙向凝膠電泳分離不溶 性含硒蛋白。使用 LA-ICP-MS 找出分離后的含硒蛋白斑 點(diǎn)，經(jīng)切割后，用胰蛋白酶消化；所得多肽通過(guò)毛細(xì)管 HPLC-ICP-MS 進(jìn)行分析，然后用電噴霧離子化 (ESI-) MS/MS 進(jìn)行表征，鑒定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油 醛-3-磷酸酯脫氫酶-3。由于胰蛋白酶裂解產(chǎn)物量非常少， 所以需要使用毛細(xì)管色譜。

實(shí)驗(yàn)部分：

樣品 硒含量為 2.3 mg/g 的市售富硒酵母樣品。

樣品前處理 采用過(guò)去文獻(xiàn)[3]所述的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)提 取、雙向凝膠電泳分離和目標(biāo)斑點(diǎn)的胰酶裂解。

HPLC-ICP-MS 和 ESI-MS/MS 分析 使用配備毛細(xì)管泵（部件號(hào) G1376A）和手動(dòng)進(jìn)樣閥（100 nL 定量環(huán)）的 Agilent 1100 LC。取 8 µL 胰酶裂解產(chǎn)物加入 到 Agilent Zorbax 300 SB-C18 35 x 0.5 mm 5 µm 多肽卡 套柱上，采用流速 20 µL/min 的等度洗脫，流動(dòng)相為 2% 乙 腈 (ACN) - 0.1% 甲酸 (FA)。使用流動(dòng)相沖洗樣品 2 分鐘， 然后反沖到 Agilent Zorbax 300SB-C18 150 x 0.3 mm x 3.5 µm 分離柱上。使用梯度洗脫分離多肽，A：水 + 0.1% FA；B：ACN + 0.1% FA ，流速 4 µL/min。洗脫程序見(jiàn)表 1。

使用 20 ppb Y、Li、Tl、Ce 的 2% 硝酸溶液優(yōu)化等離子體 條件和檢測(cè)參數(shù)。使用高能量氦碰撞池模式排除對(duì)硒同位 素的多原子干擾。使用各 250 ms 的駐留時(shí)間采集 77Se、 78Se、80Se。
ESI LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀采用正離子模式；加熱器 和毛細(xì)管溫度分別為 50 °C 和 280 °C。采用碰撞誘導(dǎo)解 離 (CID) 在 MS SIM 模式下（15% 標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量）對(duì) 300–1100 m/z 質(zhì)量范圍進(jìn)行測(cè)量；碰撞能量設(shè)置為 55% 時(shí) HCD 池中產(chǎn)生子離子。

結(jié)果和討論
蛋白質(zhì)在凝膠上的分離結(jié)果如圖 1 所示。選擇用于證明 ICP-MS 輔助蛋白質(zhì)組學(xué)方法可行性的斑點(diǎn)用圓圈標(biāo)出。根 據(jù) LA-ICP-MS 測(cè)量結(jié)果，該蛋白斑點(diǎn)在膠上所有斑點(diǎn)中硒 含量高。
對(duì)該目標(biāo)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行胰酶裂解后的分離色譜圖見(jiàn)圖 2。毛 細(xì)管 HPLC-ICP-MS 檢測(cè)了 6 個(gè)峰（圖 2a），其中 5 個(gè)可 以用 ESI Orbitrap MS/MS 進(jìn)行鑒定。ICP-MS 檢測(cè)對(duì)確定 硒肽的保留時(shí)間非常重要，可幫助找到質(zhì)譜圖中較小的硒 形態(tài)，如圖 2d 所示。使用基線 20 點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)差的 3 倍計(jì)算檢 測(cè)限 (LOD)。將該值與 1 ppm SeMet 信號(hào)進(jìn)行比較。所得 到的硒同位素 80 的 LOD（30% ACN，0.1% FA 條件下） 為 0.2 pg。氨基酸縮寫(xiě)列表見(jiàn)表 3。
鑒定出的硒肽序列見(jiàn)表 4。使用 ICP-MS 檢測(cè)所得信號(hào)與 ESI Orbitrap MS 在已鑒定硒肽對(duì)應(yīng)的 m/z 值的選擇離子 模式（圖 2c）所得的保留時(shí)間*匹配。通過(guò)所得數(shù)據(jù)鑒 定出了含硒的甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶-3（表 5）。證明由 于蛋白鏈中的硫-硒取代途徑而引入硒，存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 殘基中，后者在酵母樣品中*發(fā)現(xiàn)。

結(jié)論:本文建立了有效的安捷倫ICP-MS輔助蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用于鑒 定市售富硒酵母樣品不溶性硒組分中的含硒蛋白。采用雙 向凝膠電泳分離含硒蛋白，并用胰蛋白酶進(jìn)行裂解。采用 LA-ICP-MS、毛細(xì)管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 組合 方法對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、分析和表征。由于胰酶裂解產(chǎn) 物量非常少，所以需要使用毛細(xì)管色譜。采用本方法鑒定 出了甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶-3，這是富硒酵母中的主要含 硒蛋白。證明由于蛋白鏈中的硫-硒取代途徑而引入硒，存 在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 殘基中，后者在酵母樣品 中*發(fā)現(xiàn)。