文獻(xiàn)速遞

引言

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康研究所、寧波大學(xué)食品與藥學(xué)院中國(guó)食品科學(xué)與技術(shù)系、島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司聯(lián)合研究，成功建立并驗(yàn)證了適用于血清中多種維生素D代謝物的高通量、高靈敏度SFC-MS/MS分析方法。

由于研究?jī)?nèi)容較多，故分為上、下兩期來進(jìn)行詳細(xì)介紹。本期主要介紹內(nèi)容為：研發(fā)背景、樣品前處理、如何建立及優(yōu)化SFC-MS方法等。

文章出處

Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23

島津Nexera UC全相系統(tǒng)之SFC-MS系統(tǒng)

本研究采用島津超臨界流體色譜儀Nexera UC、島津三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀LCMS-8060

● 超臨界流體與改性劑配合使用，可在更大范圍內(nèi)滿足不同極性化合物的檢測(cè)需要；

● 低死體積和背壓控制單元有效降低脈動(dòng)，提高靈敏度；

● 溶劑使用量少且分析時(shí)間短，是一種綠色環(huán)保、高效的分析手段。

研究背景

維生素D（VD）作為一種脂溶性類固醇，在鈣穩(wěn)態(tài)和骨骼健康中起著重要作用，其主要以麥角鈣化醇（VD₂）和膽鈣化醇（VD3）兩種形式存在，多通過皮膚光照和食物或膳食補(bǔ)充劑來獲取。VD進(jìn)入體內(nèi)參與生物調(diào)控，須在肝臟及腎臟內(nèi)進(jìn)行羥基化等復(fù)雜的代謝途徑反應(yīng)，因此其代謝產(chǎn)物結(jié)果是VD臨床評(píng)價(jià)的主要挑戰(zhàn)之一。

對(duì)于正常人血清或血漿中含有痕量1,25-(OH)₂ VD₂和1,25-(OH)₂ VD₃，分析時(shí)應(yīng)考慮進(jìn)一步改進(jìn)定量限(如衍生化)。與LC-MS/MS法相比，采用超臨界流體色譜儀（SFC）作為質(zhì)譜前端，不僅降低了有機(jī)溶劑成本，還有具有更快分析速度及更高靈敏度。

樣品前處理

采用3.5 mL真空血管采集空腹血樣，凝固后1500 ×g離心30 min。上層血清移入無菌管，-80℃保存后用于分析。 

建立及優(yōu)化SFC-MS分析方法

1. SFC色譜柱的選擇

考察了10種VD代謝物分別在Diol、CN、NH2、PFP和C18 5根色譜柱上的洗脫性能，并評(píng)價(jià)了不同固定相的選擇性。如圖1，除C18柱外，其他4根色譜柱上VD代謝產(chǎn)物色譜峰均為正常的洗脫順序，保留時(shí)間隨羥基數(shù)量的增加而增加。其中PFP柱能夠分離所有VD代謝產(chǎn)物，分離效果最佳，特別是25-OH VD2/VD3及其對(duì)映體的分離，并被選擇用于進(jìn)一步開發(fā)。

圖1：A) Diol, B) CN, C) NH₂, D) PFP, E) C18色譜柱上VD代謝產(chǎn)物的固定相化學(xué)結(jié)構(gòu)和洗脫順序。

1: 25-OH VD₃和3-epi-25-OH VD₃;

2: 25-OH VD₂和3-epi-25-OH VD₂;

3: VD_3;

4: VD₂;

5: 1,25-(OH)₂ VD₃;

6: 1,25-(OH)₂ VD₂;

7: 24，25-(OH)₂ VD₃;

8: 24，25-(OH)₂ VD₂。

2. 梯度洗脫條件優(yōu)化

純CO₂是VD代謝物的弱洗脫溶劑，與固定相相互作用強(qiáng)。因此，為提高流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，加入甲醇作為改性劑。圖2顯示了四種不同梯度下VD代謝物的分離情況。

在Gradient 4條件下，二羥基代謝物的峰形明顯改善，這可能是由于甲醇比例的急劇增加(1.5 min內(nèi)從8%增加到40%)改善分離效果，由此減少二羥基代謝物的擴(kuò)散。因此，選擇Gradient 4進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2：四種梯度洗脫程序(流動(dòng)相A: CO2;流動(dòng)相B:甲醇，色譜柱：PFP)

虛線(-)：流動(dòng)相B的百分比；USP：分離度。(1-8序號(hào)對(duì)應(yīng)VD代謝物名稱同圖1)

3. 流速的選擇

雖然超臨界流體黏度較低，但擴(kuò)散系數(shù)較高。因此，在柱前壓力和洗脫液密度較高，設(shè)定較高流速時(shí)，梯度有望提高峰之間分離度。圖3(A)為不同流速下VD代謝物的洗脫。當(dāng)流速?gòu)?.0 mL/min增加到1.5 mL/min時(shí)，25-OH VD2/ VD3及其表異構(gòu)體的分離明顯改善，但當(dāng)流速增加到2.0 mL/min時(shí)，分離度降低。因此后續(xù)研究設(shè)定流速為1.5 mL/min。

4. 柱溫的選擇

色譜柱溫度影響流動(dòng)相粘度和界面分布。如圖3(B)所示，溫度從30℃升高到40℃，25-OH VD2/VD3及其同位異構(gòu)體的分離得到改善，但溫度再升高到50℃，分離效果較差。因此后續(xù)研究采用柱溫40℃。

圖3  A）流速和B）溫度對(duì)PFP柱上VD代謝物分離的影響。

5. MS系統(tǒng)優(yōu)化

為提高VD代謝物的電離效率，對(duì)離子源類型和補(bǔ)償劑緩沖液濃度進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)于離子源的選擇，測(cè)試了電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)，兩者都是在正離子模式下。如表1，濃度為1 ng/mL的所有VD代謝物，ESI+模式下的信噪比(S/N)比APCI+模式下的高4~6倍。因此, 在ESI+模式下評(píng)估不同濃度緩沖液，當(dāng)甲酸銨濃度從1 mM增加到5 mM, S/N較好；將甲酸濃度從0.5‰(v/v)提高到1% (v/v)可進(jìn)一步優(yōu)化靈敏度，但甲酸濃度為2‰ (v/v)則沒有進(jìn)一步提高靈敏度。因此，采用ESI+進(jìn)行電離，選擇5 mM甲酸銨和1‰ (v/v)甲酸作為補(bǔ)償劑。

表1 離子源類型和緩沖液對(duì)維生素D代謝物信噪比(S/N)的影響(1 ng/mL)

FA: 甲酸;  AmFc: 甲酸銨

本期小結(jié)

本研究建立了適用于血清中多種維生素D代謝物的SFC-MS方法，并通過優(yōu)化分析條件，確定最佳分析條件為：PFP色譜柱、梯度程序4、流速1.5mL/min、柱溫40℃，離子源類型為ESI+，補(bǔ)償劑為 5 mM甲酸銨和1‰ (v/v)甲酸。基于此分析條件下，可實(shí)現(xiàn)PFP柱可在10 min內(nèi)10種VD代謝物的基線分離;在正電噴霧電離模式下進(jìn)行檢測(cè)，允許對(duì)血清基質(zhì)中的多種VD代謝物進(jìn)行定量分析。

下一期將介紹方法驗(yàn)證 、 SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法的方法比較，敬請(qǐng)期待！

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