摘要本文介紹了包含 300 多種農(nóng)藥的觸發(fā)式 MRM 數(shù)據(jù)庫和譜庫的開發(fā)，并應(yīng)用于采用 120 種特定農(nóng)藥殘留開發(fā)的 LC/MS 方法分析多種食品。我們使用了 Agilent 1290 Infinity LC 和6460 三重四極桿 LC/MS 聯(lián)用系統(tǒng)，并在采用安捷倫噴射流技術(shù)的正離子電噴霧模式下運行。采用觸發(fā)式 MRM 采集模式進(jìn)行定量和確認(rèn)，以消除潛在的假陽性檢測結(jié)果。針對 3 類商品的 5 個代表性基質(zhì)進(jìn)行簡單的室內(nèi)驗證，證明了開發(fā)的觸發(fā)式 MRM 方法滿足定量限 (LOQ)、線性和重現(xiàn)性等方面的要求，適用于食品提取物中農(nóng)藥的分析。一些實例表明，干擾基質(zhì)峰被錯認(rèn)為是農(nóng)藥的高風(fēng)險可以通過觸發(fā)式 MRM 消除。定量結(jié)果同時顯示的自動化參考譜庫匹配可以高效地審查數(shù)據(jù)并對可疑數(shù)據(jù)進(jìn)行自動標(biāo)記。

前言食品，作為人類的一大消費品，需要進(jìn)行農(nóng)藥殘留的分析。歐盟委員會法規(guī) (EC) 396/2005 及其在 2008 年 9 月生效的附錄中對歐盟生產(chǎn)或進(jìn)口到歐盟的食品和飼料產(chǎn)品的 170000 多種不同基質(zhì)中的多種農(nóng)藥規(guī)定了最大殘留* (MRL) [1]。SANCO/12495/2011 指南 [2] 中規(guī)定了食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析方法驗證和質(zhì)量控制步驟的準(zhǔn)則。使用多殘留 LC/MS 分析方法監(jiān)測和定量數(shù)量與日俱增的農(nóng)藥?；谒鼈兂錾倪x擇性和靈敏度，分析者普遍認(rèn)為三重四極桿質(zhì)譜儀是定量多種食品中數(shù)百種低濃度農(nóng)藥的*佳儀器。然而，對于復(fù)雜基質(zhì)，一些案例已發(fā)現(xiàn)因基質(zhì)成分的保留時間與農(nóng)藥相近或相同而干擾農(nóng)藥的 MRM 譜圖，從而造成假陽性的結(jié)果 [3]。某些時候，SANCO/12495/2011 規(guī)定的鑒定標(biāo)準(zhǔn)要求要有 2 個具有恒定離子比的 MRM transition，而保留時間并沒有足夠的選擇性來進(jìn)行對于明確的鑒定。因此，我們需要采集更多的 transition 或化合物的全譜。通常，這會影響方法可以涵蓋的化合物數(shù)量。觸發(fā)式 MRM 可以使二者同時實現(xiàn)，快速的循環(huán)時間實現(xiàn)幾百種化合物的分析方法和全譜采集。根據(jù)一個或更多主要 transition的響應(yīng)，可以最多被“觸發(fā)”9 個附加 transition，從而獲得與譜庫進(jìn)行比對的化合物全譜。所以，化合物的確認(rèn)不僅依據(jù)兩個主要 MRM transition 峰面積的比值，而且依據(jù)與參考譜庫的匹配得分。因為每個碎片都是在*優(yōu)化的碰撞能量下生成的，還因為在觸發(fā)式 MRM 下每個碎片的駐留時間明顯長于全掃描下的駐留時間，因此，觸發(fā)式 MRM 的譜圖質(zhì)量要顯著優(yōu)于數(shù)據(jù)依賴的子離子掃描 [4]。此外，觸發(fā)式 MRM 通過安捷倫動態(tài) MRM 算法進(jìn)行管理，確保了主要（定量）transition 循環(huán)時間的一致性。因此，觸發(fā)式 MRM 譜圖的采集不會影響數(shù)據(jù)采集速率和定量色譜峰的峰面積。

本文根據(jù)針對農(nóng)藥殘留分析的歐盟參考實驗室 (EURL)“Checkyour-Scope”目錄，展示了包含適用于 LC/MS 分析的 300 多種最重要農(nóng)藥的觸發(fā)式 MRM 數(shù)據(jù)庫和譜庫的開發(fā)過程，并將該觸發(fā)式MRM 采集模式應(yīng)用到不同食品（檸檬、西紅柿、綠茶和生姜）中 120 種農(nóng)藥殘留的分析中。對選定基質(zhì)的 QuEChERS 萃取液進(jìn)行加標(biāo)，濃度范圍從 1 µg/kg 到 100 µg/kg。以西紅柿、檸檬和綠茶 3 種食品為代表，根據(jù) SANCO/12495/2011 進(jìn)行了室內(nèi)驗證。同時對觸發(fā)式 MRM 方法以及相應(yīng)的動態(tài) MRM 方法的性能進(jìn)行了鑒定，包括根據(jù)信號的抑制或增強 (SSE) 對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行的評估、線性測定、根據(jù)信噪比測定定量限 (LOQ)，以及通過不同加標(biāo)濃度的 5 個平行樣測定計算的重現(xiàn)性等。一些復(fù)雜基質(zhì)的實例表明，在一個或者兩個主要 MRM 譜圖上有干擾，但觸發(fā)式 MRM 提供的更多有價值的信息可以避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

實驗試劑與化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LCMS 級。乙腈和甲醇購于 Baker公司（Mallinckrodt Baker，Deventer，荷蘭）；超純水用配有0.22 µm 濾膜過濾終端的 Milli-Q 集成系統(tǒng)制備（EMD Millipore，Billerica，MA，美國）；甲酸購自 Fluka 公司（Fluka AG，Buchs，瑞士）；甲酸銨溶液 (5M) 來自安捷倫公司（部件號 G1946-85021）；絕大多數(shù)農(nóng)藥分析標(biāo)準(zhǔn)品購自 Dr. Ehrenstorfer 公司（Augsburg，德國）。溶液與標(biāo)準(zhǔn)液根據(jù)其理化性質(zhì)的相似性，將單個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，用乙腈配成8 個混標(biāo)，每個分別含有 30 到 40 種化合物，濃度均為 10 µg/mL，–20 °C 下保存。臨用前，將 8 個混標(biāo)進(jìn)一步混合，用乙腈配成濃度為 1 µg/mL，含有 300 多種化合物的農(nóng)藥混標(biāo)溶液。該溶液用于向 QuEChERS 萃取液中加標(biāo)和制備校準(zhǔn)樣品。用純乙腈制備范圍從 0.1 到 100 ng/mL 共 8 個濃度的校準(zhǔn)樣品。樣品前處理水果和蔬菜、干燥的菊花茶和綠茶均購于當(dāng)?shù)氐氖卟怂?。根?jù)法定的檸檬酸鹽緩沖液的 QuEChERS 方法 [5]，采用安捷倫BondElut QuEChERS 試劑盒（部件號 5982-5650）進(jìn)行樣品前處理。稱取 10 g 均漿的水果和蔬菜，或者 2 g 菊花茶或綠茶，置于50 mL 塑料試管中。用 10 mL 超純水將菊花茶或綠茶浸濕。所有樣品均使用 10 mL 乙腈用力振蕩萃取 1 min。只有檸檬的勻漿液后來又加入 600 µL 5 M 的氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和。將含有 4 g 無水 MgSO4、1 g NaCl 和 1.5 g 緩沖檸檬酸鹽的萃取鹽包加入每個試管中使分層，將試管再振搖 1 min，并在 3000 rpm 的速度下離心 5 min。將 6 mL 上層乙腈液轉(zhuǎn)移至安捷倫 BondElut QuEChERS EN 分散型 SPE 萃取管中（部件號 5982-5256），該萃取管中含有用于凈化的 150 mg N- 丙基乙二胺 - (PSA) 和 15 mg 石墨化碳黑 (GCB)，以及用于去除水分的 900 mg MgSO4。將萃取管封閉，渦旋1 min。然后在 3000 rpm 的速度下離心 5 min。將澄清的萃取液轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶中，向每毫升萃取液中加入 10 µL 5% 的甲酸乙腈溶液，以提高目標(biāo)農(nóng)藥的穩(wěn)定性。為了評估重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)，提取了空白西紅柿、生姜、檸檬、綠茶和菊花茶的樣品，并且通過向樣品的 QuEChERS 空白萃取液中加入適量的最終農(nóng)藥混標(biāo)溶液，配制成 3 個濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品?；|(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)品配制完成后要立即進(jìn)樣分析，并平行測定 5 次。

儀器設(shè)備樣品分離使用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)，包括 Agilent1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290 Infinity 高性能自動進(jìn)樣器 (G4226A)，以及 Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)。UHPLC 系統(tǒng)與配備了安捷倫噴射流電噴霧離子源的 AgilentG6460A 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用。使用 MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

……

結(jié)論食品中農(nóng)藥的假陽性鑒定是質(zhì)控實驗室關(guān)注的重點問題。在基質(zhì) - 農(nóng)藥組合存在的情況下，如果只采集 2 個 MRMtransition，就會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。在本文中，我們將觸發(fā)式 MRM 與譜庫參考譜圖檢索相結(jié)合，有效地消除了潛在的假陽性結(jié)果。因為每個 MRM transition 都使用了優(yōu)化的碰撞能量和合理的駐留時間，即使在非常低的濃度下和復(fù)雜的基質(zhì)中，觸發(fā)式 MRM 仍可以生成可靠的化合物譜圖。良好的線性校準(zhǔn)曲線和重復(fù)測定優(yōu)異的精密度表明，在觸發(fā)了附加 transition 進(jìn)行定性的情況下，定量結(jié)果未受到絲毫影響。觸發(fā)式 MRM 只需通過一次分析運行，即可實現(xiàn)對大量農(nóng)藥準(zhǔn)確的定性和定量。僅通過使用一個主要 transition，觸發(fā)式 MRM 能將多殘留方法分析化合物的范圍擴大為目前以定量和定性 transition 為鑒定依據(jù)方法的 2 倍。該開發(fā)的數(shù)據(jù)庫和譜庫作為安捷倫觸發(fā)式 MRM 譜庫和數(shù)據(jù)庫的一部分可供使用。其中包括了 600 多種農(nóng)藥的 transition、分析條件和譜圖，安捷倫產(chǎn)品部件號為 G1733CA，或者部件號G1733BA 產(chǎn)品，其中還包括了色譜柱、綜合農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)的應(yīng)用支持