摘要：本文開發(fā)了一種可同時(shí)測(cè)定葡萄酒中八種真菌毒素的方法，包括黃曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2、展青霉素、嘔吐毒素、赭曲霉毒素 A 以及 玉米赤霉烯酮。在氯化鈉和硫酸鎂存在的條件下，采用乙腈對(duì)樣品進(jìn)行初步提取。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法對(duì)得到的提取物進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行復(fù)溶，再利用超高效液相色譜 (UHPLC) 三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)模式 (MRM)檢測(cè)。結(jié)果表明在紅葡萄酒和白葡萄酒中八種真菌毒素的檢測(cè)限 (LOD) 分別在 0.050 至3.3 µg/L 和 0.030 至 8.0 µg/L 范圍內(nèi)，定量限 (LOQ) 分別介于 0.15 至 2.5 µg/L 和 0.10至 25 µg/L 范圍內(nèi)。對(duì)于全部八種真菌毒素，在選定的兩個(gè)數(shù)量級(jí)的基質(zhì)匹配校準(zhǔn)范圍內(nèi)線性響應(yīng)良好，線性回歸系數(shù)為 0.995 或更高。對(duì)于所測(cè)定的兩個(gè)加標(biāo)水平，回收率介于 59.6–132.4%，精密度 (RSD) 介于 1.2–21.1% (n = 6)。其中，大部分加標(biāo)樣品的回收率為 70%–120%，RSD 小于 10%。本文開發(fā)的方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于葡萄酒中多種真菌毒素的高通量常規(guī)篩查，并可能擴(kuò)展到其它發(fā)酵酒類樣品的應(yīng)用中。

前言真菌毒素是由各種真菌在適宜的氣候條件下自我復(fù)制而生成的一系列次級(jí)代謝產(chǎn)物。已見諸報(bào)道的真菌毒素有 300 余種。研究表明一些真菌毒素會(huì)導(dǎo)致多種不良健康效應(yīng)，包括抑制免疫系統(tǒng)，誘發(fā)癌癥及畸形，干擾生長(zhǎng)發(fā)育，等等 [1,2]。用于釀酒的農(nóng)產(chǎn)品（例如葡萄）在生長(zhǎng)、儲(chǔ)存和加工過程中易感染真菌，進(jìn)而受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素 A (OTA) 是葡萄酒中最常見的一種真菌毒素 [3-5]。歐盟 (EU) 規(guī)定酒中 OTA 的最高*為 2 µg/L。事實(shí)上許多其它的真菌毒素也可能存在于釀造完成的酒中，例如黃曲霉毒素（B1、B2、G1 和 G2），嘔吐毒素 (DON)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、展青霉素 (PAT) [6,7]。一些國(guó)家和國(guó)際組織已經(jīng)規(guī)定了大多數(shù)原始農(nóng)產(chǎn)品中這類真菌霉素的最高*。但是，這些真菌毒素在酒中的*至今并沒有得到太大的關(guān)注。不同于其它食物商品，酒是一種特殊的飲品，其主要成分為酒精。與真菌毒素自身對(duì)人體健康的影響相比，在飲酒的同時(shí)攝入真菌毒素可能會(huì)加重影響。一篇近期的報(bào)道指出，小鼠同時(shí)攝入黃曲霉毒素 B1（一種致癌的真菌毒素）及乙醇表現(xiàn)出加合效應(yīng)，會(huì)顯著加重對(duì)其肝臟的氧化損傷 [8]。與其它食品相比，人體對(duì)酒中某些真菌毒素的耐受性可能較低，因此，需要建立一種靈敏可靠的方法對(duì)酒中的潛在真菌毒素進(jìn)行常規(guī)篩查，以確保消費(fèi)者的安全。對(duì)酒中的潛在真菌毒素進(jìn)行常規(guī)篩查以確保安全性。高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-ESI-MS/MS)，結(jié)合多種預(yù)提取技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)玉米、飼料、牛奶及草藥等基質(zhì)中的真菌毒素 [9-14]。但是，極少有報(bào)道關(guān)注葡萄酒中的多種真菌毒素 [15]。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)基于 UHPLC-ESI-MS/MS 技術(shù)，展示了一種用于快速有效檢測(cè)葡萄酒中潛在八種真菌毒素的高通量檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)部分試劑、化學(xué)品和樣品八種真菌毒素包括展青毒素 (PAT)、嘔吐毒素 (DON)、黃曲霉毒素G1 (AFG1)、黃曲霉毒素 G2 (AFG2)、黃曲霉毒素 B1 (AFB1)、黃曲霉毒素 B2 (AFB2)、赭曲霉毒素 (OTA) 以及玉米赤霉烯酮 (ZEN)（純度大于等于 99%）均購自 Romer 實(shí)驗(yàn)室（澳地利）。甲酸和乙酸銨分別購自美國(guó)天地及賽默飛世爾科技公司。紅葡萄酒和白葡萄酒均為進(jìn)口葡萄酒，從當(dāng)?shù)剡M(jìn)口商處隨機(jī)選擇。真菌毒素化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備采用純甲醇配制，儲(chǔ)備溶液濃度為 10 µg/mL，于 –18 °C 下儲(chǔ)存。利用甲醇/水（20:80，體積比）將其稀釋至適當(dāng)濃度用于校正。樣品前處理準(zhǔn)確量取葡萄酒樣品 2.5 mL 于離心管中,加入 20 mL 純乙腈 (ACN)混合。然后向離心管中加入氯化鈉 (2 g) 及硫酸鎂 (0.25 g)。對(duì)所得混合物渦旋振蕩 3 min 后，在 8000 rpm 下離心 10 min。將占原始體積 80% 的上清液轉(zhuǎn)移至干凈的雞心瓶中，40 °C 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘?jiān)?2 mL 甲醇/水（20:80，體積比）復(fù)溶，并用0.22 µm 膜過濾后，進(jìn)行 UHPLC-ESI-MS/MS 分析。為了檢驗(yàn)是否需要進(jìn)一步凈化，這里分別嘗試了 C18、PSA 和石墨化炭黑 (GCB) 對(duì)提取液進(jìn)行凈化。乙腈提取后所得的上清液均分為三等份加入離心管中，分別與 C18、PSA 和 GCB 混合，持續(xù)振蕩 10 min。將混合物在 8000 rpm 下離心 10 min，所得的上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)一步濃縮。所得殘?jiān)?2 mL 甲醇/水（20:80，體積比）復(fù)溶，并用 0.22 µm 膜過濾后，進(jìn)行 UHPLC-ESI-MS/MS分析。使用真菌毒素的回收率評(píng)估凈化效率。

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)為了驗(yàn)證紅葡萄酒或白葡萄酒基質(zhì)是否會(huì)影響這些真菌毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確度，根據(jù)樣品前處理步驟向葡萄酒中加入一定量的真菌毒素。采用 UHPLC-ESI-MS/MS 分析所得到的樣品。比較每種分析物與相同水平標(biāo)準(zhǔn)溶液中真菌毒素的峰面積。與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，加標(biāo)基質(zhì)樣品中峰面積比例的降低或增加分別代表基質(zhì)抑制或增強(qiáng)的程度。基質(zhì)匹配的線性校正、檢測(cè)限及定量限為了評(píng)估線性及檢測(cè)靈敏度，選用事先確定無檢測(cè)目標(biāo)分析物的空白基質(zhì)。同樣品一樣，對(duì)空白基質(zhì)進(jìn)行提取和濃縮。所得殘?jiān)褂靡幌盗腥苡诩状?水（20:80，體積比）的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行復(fù)溶?；|(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液用 0.22 µm 膜過濾后，進(jìn)行UHPLC-ESI-MS/MS 分析。對(duì)每種分析物的峰面積及其濃度進(jìn)行相關(guān)分析以驗(yàn)證線性。利用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)樣的低濃度樣品生成的S/N，計(jì)算所開發(fā)方法的檢出限 (S/N= 3) 及定量限 (S/N = 10)。準(zhǔn)確度和精度為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度，向空白基質(zhì)中加入兩個(gè)水平的各種真菌毒素作為加標(biāo)樣品，重復(fù)分析六次。由于葡萄酒、葡萄或其它可參考農(nóng)產(chǎn)品中每種真菌毒素所規(guī)定的*水平相差很大，且每種真菌毒素的質(zhì)譜靈敏度相差也很大，因此將中國(guó)法規(guī)中現(xiàn)行最高*水平及其四分之一水平作為每個(gè)分析物的加標(biāo)水平。加標(biāo)樣品前處理同樣品前處理過程相同，并采用 UHPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析。使用六次重復(fù)測(cè)定的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估方法的準(zhǔn)確度和精密度?！?/p>

UHPLC-MS/MS 條件整個(gè)研究過程中均采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)。其包括 1290 Infinity 二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱。采用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）進(jìn)行八種真菌毒素的分離。流動(dòng)相是溶液 A 和溶液 B 的在線混合物，其中 A 為純水，B 為含有 5 mmol/L 乙酸銨的甲醇。初始梯度為 10% B，0–2.4 min 內(nèi)線性增加至 42% B，然后在 2.4–6 min內(nèi)持續(xù)增加至 51% B。接著在 6.0–6.2 min 內(nèi)，% B 快速增加至90%，保持 2 min 以確保所有分析物和干擾物質(zhì)可從色譜柱中洗脫出來。流速為 0.4 mL/min，進(jìn)樣量為 5 µL，柱溫為 40 °C。兩次連續(xù)分析間的柱平衡時(shí)間設(shè)置為 1 min。UHPLC 系統(tǒng)的洗脫液由射流電噴霧 (JetStream ESI) 離子源直接進(jìn)入 Agilent 6460 三重四極桿 MS/MS 系統(tǒng)，并在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM) 下進(jìn)行檢測(cè)。正 (pos) 和負(fù) (neg) 模式下的一般離子源參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓，3500 V (pos)，2000 V (neg)；噴嘴電壓，500 V (pos)，1900 V (neg)；干燥氣溫度，325 °C；干燥氣流速，6 L/min；霧化氣壓力，45 psi；鞘氣溫度，350 °C；鞘氣流速，11 L/min。針對(duì)每種化合物優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓和碰撞能量。

結(jié)果與討論離子模式的選擇及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)的優(yōu)化在所研究的八種真菌毒素（圖 1）中，PAT、DON、OTA 和 ZEN含有羥基、酚羥基或羰基配體，較易在 ESI 過程中丟失質(zhì)子，因此需要在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析以獲取高靈敏度。相反，黃曲霉毒素含有羰基和甲氧基配體，較易在 ESI 過程中獲得質(zhì)子，因此在正離子模式下分析可以獲取較高的靈敏度。在所選擇的離子模式下，利用 6460 三重四極桿 MS/MS 系統(tǒng)分別分析溶于 20% 甲醇水溶液的各種真菌毒素。采用人工或優(yōu)化軟件優(yōu)化每個(gè) MRM 離子對(duì)的毛細(xì)管出口電壓 (fragmentaor voltage)和碰撞能量 (collision enegy)。毛細(xì)管出口電壓由 70 V 掃描至200 V，選擇最高質(zhì)譜響應(yīng)時(shí)的電壓作為優(yōu)化值，并用于進(jìn)一步的碰撞能量選擇。然后利用一系列碰撞能量（CE 由 5 V 至 50 V）裂解分析物。選擇可獲得最高強(qiáng)度和第二高強(qiáng)度碎片的碰撞能量分別作為定量和定性 MRM 離子對(duì)的優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化后的參數(shù)列于表 1。

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