摘要：傳統(tǒng)草藥被用作許多疾病的替代藥物。土壇樹(shù)就是這樣一種傳統(tǒng)藥用植物。目前已有多項(xiàng)研究使用到這種植物的提取物，這也證明了其具有治療價(jià)值。但是，極少有人嘗試確定這種植物復(fù)雜的代謝物組成。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，我們用有機(jī)溶劑和水性溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，對(duì)土壇樹(shù)樹(shù)皮上的代謝物進(jìn)行分析和鑒定。通過(guò) Agilent 1260 的分析型餾分收集系統(tǒng)對(duì)有機(jī)溶劑提取物和水提取物進(jìn)行餾分收集。并利用 LC/MS 和 GC/Q-TOF 技術(shù)分析每種餾分。使用 HILIC 色譜和三個(gè)獨(dú)立的正交反向色譜柱進(jìn)行 LC/MS/MS 分析。使用 AJS 離子源在正離子和負(fù)離子模式下收集數(shù)據(jù)，然后在 METLIN 數(shù)據(jù)庫(kù)或 MS/MS 譜庫(kù)中進(jìn)行搜索。那些未能獲得數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)匹配的八角楓屬化合物繼而還可以使用安捷倫 MSC 軟件在收錄超過(guò) 3000 萬(wàn)個(gè)結(jié)構(gòu)的 ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。為了鑒定由 GC/Q-TOF 分析結(jié)果所產(chǎn)生的化合物，可以通過(guò) AgilentFiehn GC/MS 代謝組學(xué)譜庫(kù)和 Wiley/NIST 譜庫(kù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。借助多個(gè) GC 譜庫(kù)的搜索結(jié)果鑒定出 62 種化合物，匹配得分均大于 70。使用兩種技術(shù)共檢測(cè)出 1016 種化合物，其中有 511 種化合物被成功鑒定。文獻(xiàn)檢索顯示，511 種化合物中有 81 種對(duì)癌癥、微生物感染等傳統(tǒng)疾病具有治療效果。我們的研究表明，使用餾分收集法進(jìn)行代謝物富集、用雙相溶劑提取以及正交色譜柱固定相進(jìn)行代謝物分離，并采用互補(bǔ)的 LC/MS 和 GC/MS 檢測(cè)，可以提高藥用植物的代謝物檢測(cè)范圍。

前言土壇樹(shù)是印度阿育吠陀醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)里的一種藥用植物。這種植物通常用于治療癌癥、麻風(fēng)病、糖尿病、癱瘓、微生物感染等多種疾病。植物的每個(gè)部分都可口服或者外用，具體取決于所治療的疾病類型。此前已有實(shí)驗(yàn)將這種藥用植物與特定疾病或效能建立起關(guān)聯(lián)1,2。非靶向代謝組學(xué)的綜合評(píng)估是指使用LC/MS、GC/MS 和 NMR 等互補(bǔ)的通用分析技術(shù)對(duì)所獲樣品中的生化中間體信息進(jìn)行無(wú)偏見(jiàn)分析。影響代謝組綜合評(píng)估的因素取決于：• 樣品采集/提取程序中所用的方法• 分餾• 色譜分離固定相• 電離技術(shù)/模式• 采集參數(shù)• 數(shù)據(jù)處理/分析• 數(shù)據(jù)庫(kù)/譜庫(kù)鑒定5本研究使用正交 LC/MS 和 GC/Q-TOF技術(shù)對(duì)這種植物莖皮的代謝物進(jìn)行綜合分析，包括使用新的譜庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定代謝物。

實(shí)驗(yàn)部分工作流程表 1 概述了本研究所用的工作流程。

?

試劑與材料LC/MS 級(jí)的異丙醇、甲醇和乙腈購(gòu)自 Fluka 公司（德國(guó)）。使用 Milli Q 水（Millipore Elix 10 型，美國(guó)）進(jìn)行流動(dòng)相配制。添加劑（氟化銨、乙酸、甲酸銨、甲酸和乙酸銨）購(gòu)自 Fluka 公司（德國(guó)）。

植物材料采集和提取程序從印度邁索爾附近的土壇樹(shù)上采集土壇樹(shù)樹(shù)皮并將其立即轉(zhuǎn)移至液氮中，儲(chǔ)存在 -80 °C 的溫度下備用。使用研缽和研杵將 2 g 樹(shù)皮組織在液氮中研磨為粉末。加入 40 mL 氯仿:甲醇:水比例為 1:2.5:1 (v/v/v) 的脫氣溶液，對(duì)樹(shù)皮粉末進(jìn)行提取。將未溶解的樣品用研缽和研杵碾碎 5 min，隨后將其轉(zhuǎn)移至 1.5 mL Eppendorf 管中，在 4 °C 下渦旋混合 5 min。在 20800 rpm 的轉(zhuǎn)速下將該管離心 2 min，將所有管中的上清液合并至一個(gè)玻璃樣品瓶?jī)?nèi)。將 1 mL上清液轉(zhuǎn)移至 Eppendorf 管中，加入400 μL 水。將該管渦旋混合 10 s，然后在 20800 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 2 min。分離水層（上層）和有機(jī)層（下層），并分別置于 SpeedVac 濃縮器（Eppendorf 濃縮儀）中蒸干。

餾分收集向蒸干后的水層和有機(jī)溶劑層中加入200 μL 各自分餾法所使用的流動(dòng)相 A和 B（體積比分別為 50:50 和 30:70）（表 2）。對(duì)樣品瓶進(jìn)行超聲處理使化合物重新懸浮。將裝有各種提取物的多個(gè)樣品瓶的重懸混合物注入到配備 1 mL 手動(dòng) FL 進(jìn)樣閥（部件號(hào) 5067-4191）的 Agilent 1260 Infinity 分析型純化系統(tǒng)中進(jìn)行 HPLC 分離，將餾分收集在 96 孔板的 45 個(gè)孔中，然后用SpeedVac 濃縮器蒸干。

雙重 AJS-ESI-Q-TOF MS 條件將蒸干后的水餾分重新懸浮于 250 μL50:50 甲醇:含 0.2% 乙酸的水溶液中，超聲處理 10 s，將有機(jī)溶液餾分懸浮于 30:70 流動(dòng)相 A:B（表 3 - 有機(jī)），然后在 3000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 10 min。然后，將 5 μL 重懸餾分注入與 Agilent6540 精確質(zhì)量數(shù) Q-TOF LC/MS 系統(tǒng)相連接的 Agilent 1260 Infinity LC 系統(tǒng)中。使用 API-TOF 參比質(zhì)量溶液試劑盒（部件號(hào) G1969-85001）制備參比溶液。將 10 μL HP921 和 5 μL 嘌呤溶解在 1 L 甲醇:乙腈:含 0.1% 乙酸的水(750:200:50) 溶液中，并使用等度泵在0.4 mL/min 的流速下進(jìn)行霧化。質(zhì)譜和色譜參數(shù)如表 3A 和 3B 所示。

結(jié)果與討論在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，我們使用多分離方案/電離模式和多平臺(tái)方法對(duì)土壇樹(shù)樹(shù)皮代謝物進(jìn)行了綜合分析。最初，我們注入 1 mL 提取物進(jìn)行水和有機(jī)溶劑提取物的餾分收集，以初步分離和富集代謝物。將精確質(zhì)量數(shù) MS 結(jié)果與 METLIN 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，初步發(fā)現(xiàn) 954 種化合物，其數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得分 > 90%。文獻(xiàn)檢索顯示，954 種化合物中有 81 種具有治療功效。這些治療性化合物中大多數(shù)是次級(jí)代謝物，據(jù)報(bào)道這些次級(jí)代謝物具有抗癌和抗炎活性（圖 1）。這些化合物屬于各種植物次級(jí)代謝物，如萜類、黃酮類、皂苷類、生物堿類、糖苷類等。對(duì)所有餾分進(jìn)行 AutoMSMS 分析，鑒定出449 種化合物。