摘要本文中，開(kāi)發(fā)出了一種高精度統(tǒng)計(jì)學(xué)模型用于確定商品草藥生產(chǎn)中所使用的洋甘菊的確切類型。該模型是根據(jù) Agilent 7890 GC 和 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)得到的精確 GC/MS數(shù)據(jù)而開(kāi)發(fā)。樣品的質(zhì)量控制采用主成分分析法 (PCA)，而樣品類別預(yù)測(cè)模型的建立是基于偏最小二乘判別分析法 (PLS-DA)。該模型具有識(shí)別和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。此外還通過(guò)基于 PLS-DA 的模型對(duì)據(jù)稱含有洋甘菊的 35 種商品和 11 種精油進(jìn)行了后續(xù)的預(yù)測(cè)。

前言洋甘菊作為在世界廣泛使用的藥用植物之一，具有緩解睡眠障礙、痢疾、疝氣、傷口疼痛、黏膜炎和濕疹的功效 [1,2]。洋甘菊的其他藥物屬性還包括抗過(guò)敏、抗菌、抗炎和抗痙攣等 [3]。然而，也有報(bào)道稱洋甘菊會(huì)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，包括皮疹、咽喉腫脹、呼吸短促和過(guò)敏癥。遺憾的是，目前并沒(méi)有一種普遍接受的洋甘菊表征方法，因而對(duì)于含有這種性狀不明確的天然產(chǎn)物的草藥來(lái)說(shuō)，確定和控制它們的質(zhì)量、安全性和功效會(huì)變得相當(dāng)困難。實(shí)際上，推廣草藥洋甘菊產(chǎn)品最大的障礙之一是產(chǎn)品摻假。本文介紹了新近發(fā)表的一篇研究 [4]，該研究涉及商品中最常見(jiàn)的三類洋甘菊的化學(xué)組成： 德國(guó)洋甘菊 (Matricaria chamomilla L.syn: M. recutita L.); 羅馬洋甘菊 (Chamaemelum nobile (L). All.syn: Anthemis nobilis L.) 和菊花 (Chrysanthemum morifoliumRamat.)。我們開(kāi)發(fā)出了一種氣相色譜/質(zhì)譜 (GC/MS) 方法，并利用該方法將收集的洋甘菊樣品（包括已驗(yàn)證的植物及其商品和精油）就其易揮發(fā)、非極性的化合物進(jìn)行非目標(biāo)分析。該方法通過(guò) Agilent 7890 GC 和 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。通過(guò)使用自動(dòng)數(shù)據(jù)處理程序和采用不同標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)篩選工具實(shí)現(xiàn)控制輸入變量、校準(zhǔn)保留時(shí)間和簡(jiǎn)縮數(shù)據(jù)。PLS-DA 法用于建立對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行分類和辨別的模型。該模型用于評(píng)估聲稱含有洋甘菊的商品。同時(shí)也用于鑒定與每類洋甘菊相關(guān)的主要標(biāo)志化合物。

實(shí)驗(yàn)部分樣品本文所研究的樣品包括 27 種已驗(yàn)證的植物、35 種固體商品和11 種精油。所有樣品的標(biāo)本都保存于美國(guó)密西西比大學(xué)國(guó)家天然產(chǎn)物研究中心 (NCNPR) 的植物藥材貯藏室（并具有 NCNPR 登記號(hào)）[4]。試劑和標(biāo)樣化學(xué)品和標(biāo)樣按所描述方式獲得和使用 [4]。儀器本研究采用配備 Agilent 7693A 自動(dòng)液體進(jìn)樣器的 Agilent 7890氣相色譜儀，并與 Agilent 5975 GC/MSD 系統(tǒng)聯(lián)用。表 1 中列出了儀器條件

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樣品前處理固體樣品經(jīng)研磨并混勻，以獲得均勻的基質(zhì)。大約 1 g 的細(xì)粉末經(jīng)準(zhǔn)確稱量后，分散在 4 mL 正己烷溶液中，超聲處理 1 小時(shí)。在GC/MS 分析之前采用 Millex GV (0.22 µm) 過(guò)濾器過(guò)濾上層清液。而對(duì)于精油樣品，取 10 µL 樣品溶于 1 mL 正己烷溶液中。然后將內(nèi)標(biāo)正十三烷 (n-C13H28) 加入到每個(gè)樣品溶液中，最終濃度為90 µg/mL。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用 Agilent MSD Productivity ChemStation 軟件 (E.02.02) 采集GC/MS 數(shù)據(jù)。同時(shí)使用 NIST 自動(dòng)質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件 (AMDIS)提取 GC/MS 數(shù)據(jù)。把具有相同洗脫曲線和相似質(zhì)譜數(shù)據(jù)的離子鑒定為實(shí)體 (Entity)，并以保留時(shí)間 (tR)、峰強(qiáng)度和 m/z 進(jìn)行表征。將每個(gè)樣品的 ELU 文件（由 AMDIS 創(chuàng)建）導(dǎo)入到 Mass ProfilerProfessional (MPP) 軟件中，該軟件包含了幾種樣品分類預(yù)測(cè)(SCP) 算法。豐度最小設(shè)置為 5000 響應(yīng)值 (Counts)，以用于選擇5-90 分鐘保留時(shí)間窗口內(nèi)的實(shí)體做進(jìn)一步分析。0.15 分鐘的保留時(shí)間窗口容差范圍和譜型相似性被用來(lái)在整個(gè)樣品組中進(jìn)行實(shí)體的匹配?？紤]到每個(gè)樣品間豐度的差異，使用了內(nèi)標(biāo)物對(duì)峰強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理。基于在樣品中的存在性和參數(shù)值（按標(biāo)志篩選）、出現(xiàn)頻率（通過(guò)頻率篩選）、不同種類中各自實(shí)體的豐度（通過(guò)樣品差異篩選）和單因素方差分析 (ANOVA) 的結(jié)果，對(duì)實(shí)體進(jìn)行逐級(jí)降維處理。PCA 用于樣品數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，并建立了基于 PLS-DA 的樣品分類預(yù)測(cè)模型。通過(guò)使用一系列在之前模型訓(xùn)練中使用的 12 種已驗(yàn)證植物樣品和不包含在模型訓(xùn)練中的已知標(biāo)簽商品進(jìn)行交叉驗(yàn)證流程來(lái)驗(yàn)證此模型。

結(jié)果與討論數(shù)據(jù)采集由于事先沒(méi)有定義目標(biāo)分析物的具體分組，因此采用全掃描模式進(jìn)行非目標(biāo)分析來(lái)獲取盡可能多的信息。采用 GC/MS 分析法檢測(cè)到已驗(yàn)證洋甘菊植物樣品中的大量化合物。雖然在給定類型洋甘菊植物樣品中的組分濃度稍有一些變動(dòng)，但是相同種類洋甘菊擁有一致的色譜圖型。不同類型的洋甘菊具有顯著不同的化學(xué)組分分布（圖 1）。

數(shù)據(jù)挖掘MPP 軟件對(duì) 2560 種實(shí)體進(jìn)行了分析，強(qiáng)度閾值為 5000 響應(yīng)值。采用逐級(jí)篩選程序?qū)Υ聿煌愋脱蟾示盏木咛卣餍詷?biāo)志化合物進(jìn)行鑒定，并在使用 PCA和 PLS DA方法前對(duì)數(shù)據(jù)作降維處理。本流程的第一步為“按標(biāo)志篩選”。標(biāo)志是用于標(biāo)示一種樣品中實(shí)體的品質(zhì)，并指示每個(gè)樣品中被檢測(cè)的實(shí)體是“存在”或處于“臨界”狀態(tài)的屬性。如果在所有樣品中都有該實(shí)體，就無(wú)需進(jìn)入分析。只有每個(gè)樣品中*的實(shí)體才會(huì)被保留作進(jìn)一步分析。第二步篩選中，在“通過(guò)頻率篩選”的步驟中，需要實(shí)體在至少一個(gè)樣品組（如所有的羅馬洋甘菊樣品組）中*存在，否則將會(huì)被移除。第三步為“通過(guò)樣品差異篩選”，此篩選基于實(shí)體的豐度變異系數(shù) (CV) 小于 25%。最后的篩選步驟會(huì)依據(jù)單因素方差分析計(jì)算出每個(gè)實(shí)體的 p 值，然后選擇*重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)。p 值截止值取 0.05 用于確保只有各個(gè)種類中的實(shí)體間差異具有 95% 的統(tǒng)計(jì)顯著性才能認(rèn)為通過(guò)。盡管在實(shí)施篩選程序之前，初始的實(shí)體數(shù)為 2560，但是經(jīng)過(guò)逐級(jí)篩選后，該數(shù)量降到 50。該篩選程序確保只有*判別能力的實(shí)體才被用來(lái)建立預(yù)測(cè)模型。