鏡質(zhì)合璧  還原真實(shí)

質(zhì)譜成像應(yīng)用于酶組織化學(xué)分析

摘要

檢測酶促反應(yīng)通常通過底物和酶反應(yīng)后的產(chǎn)物繼續(xù)反應(yīng)顯色并測量吸光度來實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有的酶促反應(yīng)檢測方法既要求底物和酶之間的初級反應(yīng)，又要求隨后產(chǎn)生顏色的二級反應(yīng)。一種新的酶促反應(yīng)檢測方法利用質(zhì)譜技術(shù)無需進(jìn)行二級反應(yīng)即可直接檢測初級反應(yīng)產(chǎn)物。將這種方法用于組織表面分析，還可以對酶活性進(jìn)行可視化分析。本文描述了使用高空間分辨率質(zhì)譜成像系統(tǒng)iMScope進(jìn)行酶組織化學(xué)分析的新應(yīng)用。

引言

酶在組織中的分布通常用免疫組織化學(xué)（IHC）方法來測定。雖然IHC能夠可視化表征酶蛋白的位置，但無法區(qū)分活性酶和非活性酶。酶組織化學(xué)作為一種成熟的方法，能夠可視化分析酶活性，這是無法通過IHC分析實(shí)現(xiàn)的1)，2) 。酶組織化學(xué)依賴組織切片表面上發(fā)生的酶活性化學(xué)反應(yīng)，以此識別酶活性及其強(qiáng)度。可視化分析通常將反應(yīng)底物涂敷到組織切片，組織切片與內(nèi)源酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物繼續(xù)通過另一種反應(yīng)顯色。采用這種方法，每種顯色反應(yīng)對應(yīng)一種化合物，因此，多化合物可視化分析需要進(jìn)行多種顯色反應(yīng)。使用這種方法來可視化分析酶活性的分布通常并非是一種簡單的將底物添加到組織切片的過程。作為替代常規(guī)酶組織化學(xué)顯色反應(yīng)步驟的一種方法，本研究考察了利用成像質(zhì)譜（MSI）直接檢測小鼠腦切片和整個果蠅切片中酶促反應(yīng)產(chǎn)物的方法3) 。

實(shí)驗(yàn)

本研究試圖對野生型小鼠腦切片和整個野生型果蠅切片中乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的分布進(jìn)行可視化分析。AChE能夠催化底物乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸。因此，本研究將乙酰膽堿涂敷到組織樣本的表面，并檢測其降解產(chǎn)物膽堿并評價(jià)酶活性。為與內(nèi)源性膽堿進(jìn)行區(qū)分，將氘標(biāo)記的乙酰膽堿-d9（ACh-d9）作為底物，并檢測膽堿-d9（Choline-d9）（圖1）。利用噴槍將底物手動涂敷至組織切片表面。

圖1 MSI法酶組織化學(xué)原理

將標(biāo)記后的底物涂敷于樣本表面，利用質(zhì)譜檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物，并進(jìn)行可視化分析。

本研究同時(shí)考察了進(jìn)行半定量分析的反應(yīng)時(shí)間和方法。

將α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Sigma-Aldrich）作為基質(zhì)，通過兩步法4) 進(jìn)行基質(zhì)涂敷，該方法結(jié)合了基于iMLayer基質(zhì)升華儀（圖2）的升華法和手動涂敷α-CHCA溶液的噴霧法。

使用iMScope成像質(zhì)譜顯微鏡（圖3）進(jìn)行MSI檢測，并使用IMAGEREVEA MS質(zhì)譜成像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（圖4）。iMScope實(shí)驗(yàn)參數(shù)如表1所示。

圖4 IMAGEREVEA MS質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)分析軟件

表1 MSI分析參數(shù)

結(jié)果與討論

圖 5：轉(zhuǎn)化率公式和酶活性公式

圖6

(A)  樣本組織表面底物轉(zhuǎn)化比例與酶反應(yīng)時(shí)間關(guān)系

以底物涂敷時(shí)間為0分鐘，結(jié)果顯示所有乙酰膽堿-d9（底物）在5分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽堿-d9。

(B)  乙酰膽堿酯酶活性在小鼠腦組織中比較

MSI結(jié)合HE染色分析結(jié)果顯示，酶活性在紋狀體（CPu）、海馬體（HP）和下丘腦（TH）中較高，而在胼胝體（CC）和小腦皮質(zhì)（CBX）中較低。

(C, D) HE染色和高空間分辨率成像分析小鼠海馬體酶活性

顯示CA3區(qū)中酶活性較高。標(biāo)尺：1mm

根據(jù)圖5(1)中的公式計(jì)算底物轉(zhuǎn)化率并繪制轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖表明，乙酰膽堿-d9在涂敷于樣品表面后迅速開始分解為膽堿-d9，并且在5分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化停止并耗盡乙酰膽堿-d9（圖6A）。因此，5分鐘是用以測量酶活性的足夠的反應(yīng)時(shí)間。由于組織定位相關(guān)的生物基質(zhì)效應(yīng)會給半定量分析帶來影響，圖5(2)中的公式被認(rèn)為是一種標(biāo)準(zhǔn)化方法用以校正乙酰膽堿-d9和膽堿-d9的離子化效率。

使用IMAGEREVEAL MS質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)分析軟件提取m/z 155.17乙酰膽堿-d9和m/z 113.16膽堿-d9的質(zhì)譜圖像。利用IMAGEREVEAL MS中提供的四則運(yùn)算方法，根據(jù)公式（2）計(jì)算膽堿酯酶活性分布的圖像（圖6B和圖6D）。這些圖像顯示紋狀體（CPu）、海馬（HP）和下丘腦（TH）的AChE活性較高，而胼胝體（CC）和小腦皮質(zhì)（CBX）的AChE活性較低（圖6B）。

這些結(jié)果與傳統(tǒng)酶組織化學(xué)方法高度匹配，證明該技術(shù)的可靠性。iMScope的高空間分辨率質(zhì)譜成像還用于可視化分析大腦海馬區(qū)的酶活性（圖6C、6D）。

由于哺乳動物除AChE外還產(chǎn)生丁酰膽堿酯酶（BuChE），因此嘗試對不同膽堿酯酶的活性分布進(jìn)行可視化研究。BuChE將乙酰膽堿和各種其他膽堿酯轉(zhuǎn)化為膽堿。將底物乙酰膽堿與四異丙基焦磷酸酰胺（iso-OMPA，一種BuChE抑制劑）一起涂敷于樣品表面，利用MSI觀察AChE活性的特異性分布。針對BuChE活性的特異性分布，也通過在一系列組織切片涂敷底物乙酰膽堿和AChE活性抑制劑加蘭他敏（galantamine）進(jìn)行研究。這些實(shí)驗(yàn)表明，在不含任何抑制劑樣本的胼胝體(CC)中酶活性，在很大程度上被iso-OMPA抑制，這表明胼胝體中的大部分膽堿酯酶活性是由BuChE引起的（圖7A）。

圖7

使用抑制劑后在小鼠腦切片中可視化觀察酶活性，以及整個果蠅切片中膽堿酯酶活性分布的MSI

(A)  使用抑制劑后可視化觀察酶活性

Iso-OMPA抑制丁酰膽堿酯酶活性實(shí)現(xiàn)特異性檢測乙酰膽堿酯酶活性

加蘭他敏抑制乙酰膽堿酯酶活性實(shí)現(xiàn)特異性檢測丁酰膽堿酯酶活性

(B)  果蠅中膽堿酯酶活性的分布

盡管果蠅屬于不同的門類，但該方法同樣適用，并揭示了大腦和胸腹區(qū)的酶活性。

尤其是在胸腹區(qū)，檢測到了可溶性酶活性，表明該方法可提供常規(guī)酶組織化學(xué)難以獲得的結(jié)果。

因此，將標(biāo)記穩(wěn)定同位素的底物與抑制劑一同涂敷于組織樣本表面是一種更精確的酶組織化學(xué)研究方法。

本方法甚至可以用于果蠅（一種不同門的動物）的研究。如圖7B所示，ChE活性在整個果蠅中分布不均勻，在大腦中ChE活性*，在胸腹區(qū)ChE活性也較高。果蠅頭部具有*酶活性的結(jié)果與先前報(bào)告一致5)，表明活性來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)中頭神經(jīng)節(jié)的膽堿能神經(jīng)中的AChE。相比之下，胸腹區(qū)的ChE活性很可能不是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE引起的。報(bào)告顯示除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，血液淋巴中也存在AChE6)，并且Zador等人觀察到可溶性AchE的存在，其結(jié)構(gòu)與神經(jīng)系統(tǒng)中的膜結(jié)合AChE不同7)。胸腹區(qū)的AChE活性與以往報(bào)告一致，證明本方法可有效進(jìn)行ChE活性定位的研究。

結(jié)論

本文描述了一種基于MSI進(jìn)行酶組織化學(xué)的新方法，結(jié)果顯示MSI無需顯色反應(yīng)即可獲得酶活性的半定量分布結(jié)果。該方法同時(shí)還被用于果蠅切片分析，可有效可視化分析膜結(jié)合AChE和可溶性AChE的活性。尤其是可溶性酶活性的分布難以通過傳統(tǒng)方法獲得，這顯示了本方法的*性。對于其他酶（不僅包括水解酶，還包括轉(zhuǎn)移酶），我們還將開發(fā)更多的可視化分析方法。

致謝

誠摯感謝京都工業(yè)大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)系染色體工程實(shí)驗(yàn)室的Masamitsu Yamaguchi教授提供果蠅樣本。

<參考文獻(xiàn)>

1.Takamatsu, H. Histochemische Untersuchungen der Phosphatase und deren Verteilung in verschiedenen Organen und Geweben. Trans. Soc. Path. Japan 29, 429 (1939)

2.Gomori, G. Microtechnical demonstration of phosphatase in tissue sections. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 42, 23 (1939)

3.Takeo E, Fukusaki E, Shimma S. A mass spectrometric enzyme histochemistry method developed for visualizing in situ cholinesterase activity in Mus musculus and Drosophila melanogaster. Anal. Chem. 92, 12379 (2020)

4.Shimma S, Takashima Y, Hashimoto J, Yonemori K, Tamura K, Hamada A. Alternative two-step matrix application method for imaging mass spectrometry to avoid tissue shrinkage and improve ionization efficiency. J Mass Spectrom. 48, 1285 (2013)

5.Toutant, J. P., Insect acetylcholinesterase: catalytic properties, tissue distribution and molecular forms. Prog Neurobiol. 32, 423 (1989)

6.Chadwick, L. E., Actions on Insects and Other Invertebrates. In Cholinesterases and Anticholinesterase Agents, Koelle, G. B., Ed. Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg, 1963; pp 741-798.

7.Zador, E., Tissue specific expression of the acetylcholinesterase gene in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet. 218, 487 (1989)

文獻(xiàn)題目

《質(zhì)譜成像應(yīng)用于酶組織化學(xué)分析》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Shuichi Shimma^1,2,3；Emi Takeo1；Kaoru Nakagawa；Takushi Yamamoto；Eiichiro Fukusaki^1,2,3

1 大阪大學(xué)工學(xué)研究生院生物技術(shù)系

2 大阪大學(xué)Shimadzu Omics 創(chuàng)新研究實(shí)驗(yàn)室

3 大阪大學(xué)開放與跨學(xué)科研究倡議研究所