我們提出了一種新的低能量 EI 方法來更好地了解乙醇 酸鹽的晝夜循環(huán)。乙醇酸鹽是一種可為海洋微生物循 環(huán)提供動力的代謝物。乙醇酸鹽是一種光呼吸廢產(chǎn)物， 可作為異養(yǎng)微生物的碳源和能量源。1 現(xiàn)有的乙醇酸 鹽海洋濃度測量方案一直受到回收率低、分析誤差大 以及色譜干擾的限制。2 我們提出應(yīng)用新型高效 EI 離 子源實現(xiàn)對環(huán)境相關(guān)濃度下微生物代謝物測量的高靈 敏度分析，同時減少化學(xué)干擾。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)化代 謝工作流程可更好地覆蓋已知的生物學(xué)通路，并更深 入地了解海洋微生物群落代謝的復(fù)雜性。 乙醇酸鹽在海水中的濃度范圍為 1 nmol/L– 100 nmol/L (10-9 mol/L)。 3 雖然這一濃度水平本身不 難檢測，但已有研究表明海水基質(zhì)是小分子極性代謝 物（如乙醇酸鹽）分析的一大干擾。4

標(biāo)樣和基質(zhì)空白的配制 用合成海水 (Ricca Chemical Company) 配制標(biāo)樣和溶 媒空白，合成海水中僅含海水中常見的鹽和痕量礦物 質(zhì)。用乙酸乙酯配制濃度為 1 mmol/L 的乙醇酸鹽儲 備液。所有試劑均購自 Sigma Aldrich。 天然樣品的采集和前處理 天然海水樣品采集自墨西哥灣（珀迪多基和坦帕灣）。 將沿岸帶的樣品裝在聚對苯二甲酸乙二醇酯瓶中，并 在 4 °C 下保存。理想情況下，樣品將置于干冰上冷凍 運輸，并在分析之前保持冷凍以減少酶促過程。后續(xù) 樣品均通過這種方式進行處理。

乙醇酸鹽的提取和濃縮 將每個海洋樣品等量取 10 mL，裝入 20 mL 頂空樣品 瓶。向每個樣品頂空瓶中加入內(nèi)標(biāo)。用 2 mL 1 mol/L HCl 進行酸化，使 pH 遠低于乙醇酸的 pKa。用乙酸 乙酯提取兩次，合并有機餾分。然后加入堿提高 pH 并形成甘醇酸銨。將游離酸轉(zhuǎn)化為鹽形式可減小蒸發(fā) 損失的可能性。室溫下用氮氣蒸發(fā)器吹干。用乙酸乙 酯將樣品轉(zhuǎn)移至 2 mL 樣品瓶中（每次使用 500 µL 乙 酸乙酯，共 3 次），并再次吹干。 雖然對乙醇酸鹽的分析來說并不需要，但我們希望通 過匹配 Fiehn 衍生化方案讓方法具有通用性。5 這使我 們能夠應(yīng)用通用的分析方法并鑒定其他小分子極性代 謝物（如丙酮酸鹽）。因此，我們采用甲氧基胺鹽酸 鹽使酮肟化。然后用 MSTFA (1% TMCS) 衍生化以形 成甲硅烷基衍生物。最終體積為 100 µL，這意味著濃 縮系數(shù)為 100 倍。

儀器分析 本研究采用配備芯片式保護柱和盤式色譜柱技術(shù)的 Intuvo 氣相色譜儀。芯片式保護柱實際上是一個 0.7 m × 0.53 mm 內(nèi)徑的去活化通道，能夠捕獲污染物， 以免其進入分析柱造成污染。芯片式保護柱可獨立于 進樣口進行加熱，并可用于捕獲后洗脫的化合物，或 用作進樣口的延伸部分。本研究中，由于無需進一步 優(yōu)化，我們將其用作進樣口的延伸部分。

本研究還使用了 5977B GC/MSD 所提供的新一代高 效電子電離 (EI) 離子源。在標(biāo)準(zhǔn)離子源條件下，該離 子源產(chǎn)生的離子通量通常比傳統(tǒng)離子源高 30 倍。這是 由于它采用創(chuàng)新的方式產(chǎn)生和傳輸電子，因此能夠以 比傳統(tǒng)離子源更低的發(fā)射電壓和電子能量運行。這種 操作模式能夠保持相對較高的離子通量，同時減少碎 裂并生成更多分子量更高的碎片。

LLOQ 為 1 nmol/L，有效濃度為 100 nmol/L。將其轉(zhuǎn) 換為柱上分析物時，大約為 1 pg。因此，真正的困難 并非檢測乙醇酸鹽，而是減小基質(zhì)干擾。兩種簡單的 方法可通過離子源優(yōu)化來進一步減少樣品量和/或減少 碎裂。例如，可通過將離子源溫度降至 200 °C，將電 子電壓降至 30 eV，并將發(fā)射電流減小至 20 mA，從 而減少碎裂。

如實驗部分末尾所述，快速調(diào)整離子源參數(shù)能夠減少 碎裂。從圖 3 可以看出，低質(zhì)量數(shù)碎裂減少。然而， 為檢測 220 Da 處的偽分子離子或顯著改善用于定量 分析的 M-15（甲基丟失）碎片離子的響應(yīng)，需要進 一步優(yōu)化（包括優(yōu)化增益設(shè)置）。 一種更簡單的方法是使用高離子通量來進一步減少初 始樣品量或增加分流比。

結(jié)果與討論：

乙醇酸鹽在海洋代謝中的營養(yǎng)作用 在生氧光合作用期間，將發(fā)生二磷酸核酮糖的化而非 羧化。雖然大多數(shù)光合生物采用一條或多條途徑來挽回 一部分損失，但是寡營養(yǎng)的亞熱帶環(huán)流中豐富的初級 生產(chǎn)者原綠球藻 (Prochlorococcus) 已通過基因組精簡 失去了這條途徑，或者可能由其異養(yǎng)對應(yīng)物種實現(xiàn)補救 作用。相反，將排出光呼吸生成的乙醇酸鹽。隨后，這 些乙醇酸鹽被異養(yǎng)微生物消耗。多個晝夜循環(huán)中測得的 天然海水樣品中均勻標(biāo)記的 14C-乙醇酸鹽同化和呼吸的 動力學(xué)表明，異養(yǎng)微生物能夠快速消耗該化合物。6 乙 醇酸鹽吸收及隨后的同化和呼吸的動力學(xué)依賴于光和日 間時長，雖然在晝夜循環(huán)中也發(fā)生生理變化，但是無法 與環(huán)境濃度區(qū)分開來。 過往的方法依賴于大樣品量，并將其濃縮一千倍或更多。 為了消除干擾同時獲得合理的目標(biāo)分析物回收率，樣品 前處理方法非常復(fù)雜。儀器的新發(fā)展為我們提供了兩 種新技術(shù)，使我們能夠減少基質(zhì)干擾并提高儀器的分析 靈敏度。我們的目標(biāo)是建立碳交換量的范圍，并增加對 海洋環(huán)境中光合作用與呼吸作用相互耦合的理解。

將該方法應(yīng)用于代謝流 如同光呼吸一樣，代謝任務(wù)的分配在海洋微生物群落中 似乎非常普遍。然而，我們對這些分工的懷疑大部分是 粗略的，其依據(jù)是互補途徑的分子證據(jù)，而并非直接觀 察得到結(jié)果。這一較大的知識缺口主要是由于難以定量 分析這些途徑中的細(xì)胞外“中間體” 。 目前正在開發(fā)寡營養(yǎng)海洋微生物群落中豐富的代表性 生物的詳細(xì)代謝流模型，旨在解析這些互補途徑。這種 新的分析方法使我們能夠定量分析細(xì)胞外代謝物的動態(tài)， 特別是小分子有機酸、核苷酸和糖，這些物質(zhì)被認(rèn)為可 調(diào)節(jié)微生物群落的相互作用。這些交換的代謝物的時間 分辨定量將為電腦模擬微生物群落提供流平衡限定參數(shù)。

我們的長遠目標(biāo)是開發(fā)一種多組學(xué)方法，包括對栽培和天 然微生物群落的測量，以開發(fā)針對海洋呼吸的代謝流模型。 乙醇酸鹽的定量分析是開發(fā)準(zhǔn)確模型的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前的 工作展示了以下幾個步驟： • 我們能夠使用經(jīng)典的 Fiehn 代謝組學(xué)方法定量分析乙醇 酸鹽 • 我們成功地將 Fiehn 方法與一種新型氣相色譜儀結(jié)合使 用，該色譜儀將直接色譜柱加熱的速度與用于捕獲干擾 基質(zhì)的集成芯片式保護柱相結(jié)合 • 還采用了一種新型高效 EI 離子源，將離子通量提高了 20–30 倍。這使我們獲得了乙醇酸鹽的強信號響應(yīng)，而 傳統(tǒng)方法對這一低 nmol/L 濃度范圍的分析非常困難 我們計劃將此項研究獲得的見解應(yīng)用于其他傳統(tǒng)上難以分 析但是在代謝中非常重要的有機酸。