摘要：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了用于分析三文魚和牛肉中的多環(huán)芳烴 (PAH) 殘留物的多殘留方 法的開發(fā)與驗(yàn)證。該方法使用液相萃取以及 Agilent Captiva EMR-Lipid 凈化，并通過(guò)GC/MS/MS進(jìn)行分析。使用固/液萃取 (SoLE) 對(duì)三文魚或牛肉樣品進(jìn)行萃取，再 通過(guò) Captiva EMR-Lipid 凈化。然后使用異辛烷對(duì)凈化的樣品洗脫液進(jìn)行反萃取， 以在 GC/MS/MS 分析之前去除水。在兩步法 SoLE 中使用乙酸乙酯和乙腈的混合 物，改善了脂質(zhì)食品基質(zhì)中 PAH 的萃取效率。Agilent Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱能 夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品基質(zhì)的高效選擇性凈化，并采用三文魚和牛肉樣品對(duì)開發(fā)的方法進(jìn)行 了驗(yàn)證。結(jié)果表明，所有檢測(cè)的 PAH 化合物均獲得了滿足歐盟委員會(huì)規(guī)定（回收率 50%–120%）的可接受的回收率結(jié)果，RSD 低于 20%，且三文魚和牛肉樣品中濃度 為 1–500 ng/g 的分析物的校準(zhǔn)曲線 R2 高于 0.99。通過(guò)重量法測(cè)得，三文魚和牛肉 樣品中基質(zhì)共萃取殘留物的去除效率分別為 60% 和 92%。

前言：PAH 是一類普遍存在的有毒化合物，其 特征是具有熱力學(xué)穩(wěn)定的稠合芳香環(huán)結(jié) 構(gòu)。這些化合物天然存在于原油和煤中， 也可以于食品的加工過(guò)程中形成。PAH 化合物可根據(jù)稠合芳香環(huán)的數(shù)量進(jìn)行分 類，例如分為輕 PAH（具有 2–3 個(gè)環(huán)） 和重 PAH（具有 4–6 個(gè)環(huán)）。重 PAH 比 輕 PAH 更穩(wěn)定且毒性更高。由于它們具 有疑似或經(jīng)證實(shí)的致突變性或致癌性，這 些化合物已經(jīng)得到廣泛研究和監(jiān)管。美 國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 要求對(duì)海鮮 中低 ppb 級(jí)的 PAH 進(jìn)行分析1 。歐盟委員 會(huì) (EC) 規(guī)定了四種重 PAH 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽和?）的 分析方法標(biāo)準(zhǔn)，要求每種 PAH 的定量限 (LOQ) 達(dá)到 0.9 µg/kg 且檢測(cè)限 (LOD) 達(dá) 到 0.3 µg/kg2 。 PAH 為強(qiáng)親脂性化合物，容易在魚、 肉、油和牛奶等脂質(zhì)食品中發(fā)生生物累 積。脂質(zhì)食品基質(zhì)中 PAH 的分析所面臨 的主要挑戰(zhàn)，是將目標(biāo)分析物與食品基質(zhì) 中存在的大量脂質(zhì)化合物分離。這一挑戰(zhàn) 包括從脂肪基質(zhì)中高效提取 PAH，然后 選擇性去除不需要的脂肪基質(zhì)共萃取物。 常用的樣品前處理技術(shù)包括索氏提取3 、 超聲輔助固/液萃取4 、加壓溶劑萃取5 和 QuEChERS 萃取6 。這些技術(shù)可以與固相 萃取7 (SPE) 或凝膠滲透色譜8 等凈化步驟 配合使用。

安捷倫增強(qiáng)型脂質(zhì)去除 (EMR-Lipid) dSPE 凈化產(chǎn)品自 2015 年推出以來(lái)就備受關(guān) 注。EMR-Lipid dSPE 吸附劑與脂類的無(wú) 支鏈烴鏈發(fā)生選擇性相互作用，在溶液中 留下大量目標(biāo)分析物以供后續(xù)分析。這一 選擇性相互作用使其成為脂質(zhì)食品基質(zhì)中 多類別多殘留分析的理想選擇。與傳統(tǒng)的 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid (50%) 相 比，Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱只需更少 的水進(jìn)行吸附劑活化 (20%)。這一變化簡(jiǎn) 化了工作流程，并改善了疏水性化合物在 凈化過(guò)程中的回收率9 。本研究考察了使用 Captiva EMR-Lipid 過(guò) 濾柱流通式凈化進(jìn)行樣品前處理，并通過(guò) GC/MS/MS 分析三文魚和牛肉中的 19 種 PAH 化合物。開發(fā)此方法的目的在于， 改善先前使用 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid dSPE 凈化測(cè)定食品中 PAH 的 方法的局限性10。表 1 顯示了所檢測(cè)的農(nóng) 藥的分類、Log P 值、保留時(shí)間和 MS/MS 離子對(duì)。

實(shí)驗(yàn)部分 化學(xué)品與試劑 PAH 和內(nèi)標(biāo)來(lái)自 Ultra-Scientific (North Kingstown, RI, USA) 或安捷倫。HPLC 級(jí) 乙腈 (ACN)、丙酮和乙酸乙酯 (EtOAc) 購(gòu) 自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。試 劑級(jí)異辛烷購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。 溶液與標(biāo)準(zhǔn)品 用丙酮配制兩種濃度分別為 2000 µg/mL 和 500 µg/mL 的 PAH 儲(chǔ)備液。用丙酮 由儲(chǔ)備液制得濃度為 4 µg/mL 的工作 溶液。然后每天用丙酮新鮮配制濃度為 1 µg/mL 的加標(biāo)溶液以用于樣品加標(biāo)。用 丙酮配制包含五種濃度為 20 µg/mL 的內(nèi) 標(biāo)化合物的內(nèi)標(biāo)工作溶液。兩種工作溶液 均置于棕色玻璃樣品瓶中，在 4 °C 的冰 箱中儲(chǔ)存一個(gè)月。 配制 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶劑和 16:64:20 ACN/EtOAc/水洗脫溶液，室溫 儲(chǔ)存。 儀器與材料 將 Agilent 7890B 氣相色譜系統(tǒng)與 Agilent 7000D 三重四極桿 GC/MS 聯(lián)用開展研 究。氣相色譜系統(tǒng)配備電子氣路控制 (EPC)、支持風(fēng)冷的多模式進(jìn)樣口 (MMI)、 Agilent 7693A 自動(dòng)液體進(jìn)樣器 (ALS) 以及 基于輔助 EPC 模塊控制的吹掃 Ultimate 接 頭的反吹系統(tǒng)。采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

樣品前處理設(shè)備包括： • Centra CL3R 離心機(jī) (Thermo IEC, MA, USA) • Multi Reax 試管振蕩器 (Heidolph, Schwabach, Germany) • 2010 Geno/Grinder (Metuchen, NJ, USA) • 移液管和重復(fù)用移液器 (Eppendorf, NY, USA) • 安捷倫正壓 48 孔處理裝置 (PPM-48) （部件號(hào) 5191-4101） • Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱，3 mL， 300 mg（部件號(hào) 5190-1003） • 陶瓷均質(zhì)子（部件號(hào) 5992-9312）

儀器條件 GC/MS/MS 儀器條件基于先前發(fā)表的方 法確定11。表 2 列出了 GC/MS/MS 操作 條件。

圖 1 顯示了使用既定 GC/MS/MS 條件獲 得的加標(biāo)三文魚樣品中加標(biāo)濃度為 1 ng/g 的各種 PAH 化合物的典型 MRM 色譜圖。 樣品前處理 深海捕撈的三文魚和有機(jī)牛肉購(gòu)自當(dāng)?shù)仉s 貨店，將它們切成小塊，并儲(chǔ)存在 –20 °C 下。使用機(jī)械研磨機(jī)通過(guò)干冰將冷凍樣品均質(zhì)化。然后稱取均質(zhì)化樣品 (2.5 g) 至 50 mL 離心管中，并根據(jù)需要加入標(biāo)準(zhǔn) 品和內(nèi)標(biāo)溶液。然后使用圖 2 所示的程 序?qū)θ聂~和牛肉樣品進(jìn)行前處理，該程 序包括三個(gè)主要部分： 1. 通過(guò)兩步固液萃取 (SoLE) 進(jìn)行樣品 萃取，如淺藍(lán)色框中所示2. 使用 Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱對(duì)樣品 提取物進(jìn)行凈化，如淺紫色框中所示 3. 使用異辛烷反萃取 (BE) 進(jìn)行除水后 處理，如淺綠色框中所示 整個(gè)工作流程將原始樣品濃度稀釋四倍。

基質(zhì)共萃取物去除效率評(píng)估 對(duì)樣品共萃取物殘留進(jìn)行重量測(cè)定，由此 考察基質(zhì)去除率。利用失重測(cè)定法來(lái)測(cè) 定共萃取物殘留量9 ，研究樣品萃取和凈 化程序的基質(zhì)去除率?；?1 mL 最終樣 品提取物 (n = 2) 來(lái)采集共萃取物殘留重 量，在適用的情況下校正稀釋倍數(shù)，并利 用平均重量確定基質(zhì)去除率 (%)。 也可基于 1 mL 樣品干燥后剩余的殘留物 的量直觀觀察 Captiva EMR 的凈化效率。 方法驗(yàn)證 在三文魚和牛肉樣品的分析物回收率、定 量準(zhǔn)確度和精密度、定量限 (LOQ) 和校準(zhǔn) 曲線線性方面對(duì)優(yōu)化的樣品前處理方法進(jìn) 行驗(yàn)證。三文魚和牛肉樣品的校準(zhǔn)曲線 濃度包括 1、2、5、10、20、50、100、 250、400 和 500 ng/g。根據(jù)校準(zhǔn)曲線對(duì) 三種濃度的三文魚或牛肉 QC 樣品進(jìn)行定 量分析，且 n = 6。這三種 QC 樣品分別 是低濃度 (1 ng/g)、中等濃度 (10 ng/g) 和高濃度 (100 ng/g) 樣品。由保留時(shí)間 和 MRM 離子對(duì)確定分析物鑒定和定量 結(jié)果。

結(jié)果與討論 EMR-Lipid 吸附劑和產(chǎn)品 EMR-Lipid 吸附劑使用新型化學(xué)鍵合相，它 結(jié)合了體積排阻與疏水相互作用，可提供 較高的脂質(zhì)去除選擇性和效率。僅含有無(wú) 支鏈烴鏈的類脂分子能夠進(jìn)入 EMR-Lipid 吸附劑孔中，并通過(guò)疏水相互作用得以保 留。不含類脂結(jié)構(gòu)的目標(biāo)分析物無(wú)法進(jìn)入 吸附劑孔中，因此留在溶液中以供后續(xù)分 析。因此，EMR-Lipid 吸附劑可以將脂質(zhì) 與其他目標(biāo)分析物分開，提供較高的分析 物回收率和脂質(zhì)去除效率。 樣品前處理優(yōu)化 樣品前處理方法優(yōu)化包括三個(gè)階段： 1. SoLE 2. Captiva EMR-Lipid 凈化 3. 用于除水的后處理 萃取步驟對(duì)于實(shí)現(xiàn)脂肪基質(zhì)中疏水性 PAH 化合物的高回收率至關(guān)重要。樣品萃取的 挑戰(zhàn)在于 PAH 分析物的高疏水性和脂質(zhì)食 品基質(zhì)的復(fù)雜性。鑒于 SoLE 先前在萃取 油基質(zhì)中疏水性農(nóng)藥方面的成功應(yīng)用9 ， 直接使用 SoLE 和 20:80 EtOAc/ACN 萃取 溶劑作為初步方案。針對(duì)分析物回收率對(duì) 萃取時(shí)間和多次 SoLE 進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如 圖 3A 所示。結(jié)果表明，萃取時(shí)間越長(zhǎng)， PAH 萃取回收率越高。另外，與一步法 SoLE 相比，兩步法 SoLE 提高了萃取效 率。因此，使用兩步法 SoLE 作為最佳萃 取方法，該方法采用 5 mL 萃取溶劑，并 在每一步振搖 10 分鐘。

然后研究了 EMR-Lipid 過(guò)濾柱凈化的分 析物回收率。由于 PAH 化合物具有非常 強(qiáng)的親脂性（重 PAH 尤其如此），因此 使用二次洗脫對(duì)于獲得良好的洗脫回收 率非常重要。結(jié)果（圖 3B）表明，二次 洗脫能夠使洗脫回收率平均提高約 20%– 25%。此外，使用更強(qiáng)的溶劑（16:64:20 EtOAc/ACN/水）可實(shí)現(xiàn)重 PAH 的最佳 洗脫。 對(duì)樣品萃取和 EMR-Lipid 凈化進(jìn)行優(yōu)化 后，考察了用于除水的后處理步驟。用于 在 GC/MS/MS 分析之前除水的 EMR-Lipid 后處理方法主要有三種： • 使用無(wú)水 MgSO4 進(jìn)行鹽析 • 干燥和復(fù)溶 • 疏水性溶劑反萃取 (BE) 表 3 分別列出了這三種后處理程序的一 般方法、優(yōu)缺點(diǎn)和適用性。由于 PAH 是 一類強(qiáng)疏水性化合物，因此非常適合采用 疏水性溶劑反萃取法。該方法可實(shí)現(xiàn)溶 劑轉(zhuǎn)換和部分濃縮，并且對(duì)于輕 PAH 和 重 PAH 化合物均適用。因此，在 Captiva EMR-Lipid 凈化后使用異辛烷溶劑 BE 除水。圖 3C 顯示了異辛烷 BE 步驟的回 收率。 使用這種優(yōu)化的方法，在三種加標(biāo)濃度下 采集整個(gè)方法的分析物回收率：三文魚 和牛肉樣品中加標(biāo)濃度均為 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。盡管不同基質(zhì) 間存在差異，但兩種基質(zhì)中不同加標(biāo)濃度 的所有 PAH 分析物的回收率均處于可接 受的限值范圍 (50%–120%)。