摘要：本文采用安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，建立了同時(shí)檢測(cè)主要谷物中 16 種 真菌毒素的分析方法。小麥、玉米、稻谷等樣品經(jīng)粉碎后采用乙腈-水-乙酸 溶液（70:29:1，v/v/v）提取，樣品溶液經(jīng) Agilent Eclipse Plus C18 色譜柱 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) 分離，使用配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源的安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)采用 14 種 13C 標(biāo)記的真菌毒素作為穩(wěn)定同 位素內(nèi)標(biāo)來(lái)提高方法的準(zhǔn)確度。本方法前處理操作簡(jiǎn)單，線(xiàn)性相關(guān)性 良好，相關(guān)系數(shù) R2 > 0.996；在小麥、玉米基質(zhì)中 16 種真菌毒素 3 個(gè)水平的加標(biāo) 回收率基本都在 85%-120% 之間，平行樣品測(cè)定的 RSD 在 0.7%-8.2% 之間。采用 本方法對(duì) FAPAS 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定值符合 FAPAS 的規(guī)定值，驗(yàn)證了方法 的準(zhǔn)確性。在此基礎(chǔ)上建立了同時(shí)測(cè)定 16 種真菌毒素的 UHPLC-MS/MS 電子方 法 (e-Method)，使方法建立與優(yōu)化大大簡(jiǎn)化。通過(guò)在國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同型號(hào) 的安捷倫液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)上采用 e-Method 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證，證實(shí)了檢測(cè)方法的 準(zhǔn)確性和 e-Method 的可行性。

 前言：真菌毒素是真菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一系列有毒有害物質(zhì)， 目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素大約有 400 多種[1,2]，對(duì) 人類(lèi)和動(dòng)物具有致癌、致畸和致突變等毒性[3,4]。糧食中 的真菌毒素種類(lèi)很多，常見(jiàn)的有黃qu霉毒素 (AFT)、赭曲 霉毒素 (OTA)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON)、伏馬毒素 (FB) 和 T-2 毒素 (T-2) 等。對(duì)糧食中真菌 毒素污染及時(shí)、快速的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和控制，為人類(lèi)提供安 全的口糧、為動(dòng)物提供安全的飼料，成為擺在各國(guó)面前的 一個(gè)重要課題。目前，真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色 譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。對(duì)于多殘留分析和污染物分析，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜已被證明是一個(gè)強(qiáng)大的工具，可實(shí)現(xiàn)不同谷物中 多種真菌菌素的同時(shí)測(cè)定[5]，具有高靈敏度和高選擇性。 本文采用安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，建立了同時(shí)快 速檢測(cè)主要谷物中常見(jiàn)的 16 種真菌毒素的可靠定量方法。 該方法可以滿(mǎn)足對(duì)谷物中常見(jiàn)多種真菌毒素的高通量快速 監(jiān)測(cè)。

實(shí)驗(yàn)部分： 試劑和樣品 所有試劑和溶劑均為色譜純級(jí)或者分析純級(jí)。甲醇、乙 腈購(gòu)自德國(guó)默克 (MERCK)。甲酸、乙酸、乙酸銨購(gòu)自美 國(guó) Sigma-Aldrich 公司。16 種真菌毒素包括雪腐鐮刀菌烯 醇 (NIV)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON)、脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇-3-葡萄糖苷 (DON-3G)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?(3-AcDON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?(15-AcDON)、 黃qu霉毒素 B1 (AFB1)、黃qu霉毒素 B2 (AFB2)、黃qu霉毒素 G1 (AFG1)、黃qu霉毒素 G2 (AFG2)、赭曲霉毒素 A (OTA)、T-2 毒素 (T-2)、HT-2 毒素 (HT-2)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、伏馬毒素 B1 (FB1)、伏馬毒素 B2 (FB2)、雜色曲霉毒素 (ST)，14 種 同位素內(nèi)標(biāo)包括 [13C15]-NIV、[ 13C15]-DON、[ 13C17]-3-AcDON、 [ 13C17]-AFB1、[ 13C17]-AFB2、[ 13C17]-AFG1、[ 13C17]-AFG2、[ 13C20]- OTA、[ 13C24]-T-2、[ 13C22]-HT-2、[ 13C18]-ZEN、[ 13C34]-FB1、[ 13C34]- FB2、[ 13C18]-ST 購(gòu)自 Romer 實(shí)驗(yàn)室（奧地利）。

儀器和設(shè)備 采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，其配備安 捷倫組件有以下兩種方案： • G4220A 型二元泵、G4226A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C 型柱 溫箱 • G7120A 型高速泵、G7167B 型高通量進(jìn)樣器、G7116B 型 多柱柱溫箱 采用配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源的 Agilent 6460/6470/6490/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。 采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、確證和 定量分析。 標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別配制 16 種真菌毒素的單標(biāo)儲(chǔ)備液，其中 AFB1、AFB2、 AFG1 和 AFG2 采用甲醇做溶劑，F(xiàn)B1、FB2 采用乙腈:水（50:50， v/v）做溶劑，其余化合物采用乙腈做溶劑，于 -20 °C 保 存。分別移取一定體積的 16 種真菌毒素單標(biāo)儲(chǔ)備液于 10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，配制真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作 液，于 -20 °C 保存，濃度詳見(jiàn)表 1。分別移取一定體積的 14 種真菌毒素穩(wěn)定同位素單標(biāo)溶液于 10 mL 容量瓶中，用 水定容至刻度，配制穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于 -20 °C 避光保存，濃度詳見(jiàn)表 2。

樣品前處理 小麥、玉米、稻谷等樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò) 1 mm 孔徑試驗(yàn) 篩，混勻。準(zhǔn)確稱(chēng)取 5 g 制備好的樣品于 50 mL 離心管中， 加入 20 mL 提取液乙腈-水-乙酸混合液（70:29:1，v/v/v）， 并用渦旋混合器混勻 1 min，置于旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩提取 30 min，然后以 6000 r/min 離心 10 min，吸取 0.5 mL 上清液 于 1.5 mL 離心管中，加入 0.5 mL 水并渦旋混勻，在 4 °C 下 以 12000 r/min 離心 10 min，上清液過(guò) 0.2 μm 的聚四氟乙烯 濾膜。吸取 180 µL 樣品濾液于 400 µL 內(nèi)插管中，加入 20 µL 穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，渦旋混勻待測(cè)。

液相色譜條件 色譜柱： Agilent Eclipse Plus C18，2.1 × 100 mm， 1.8 μm，部件號(hào) 959764-902 流速： 0.3 mL/min 柱溫： 35 °C 進(jìn)樣體積： 2 μL 流動(dòng)相： A）含 1% 乙酸和 5 mmol/L 乙酸銨的水溶液 B）甲醇 梯度程序： 時(shí)間 (min) B% 0.0 10.0 2.0 10.0 3.0 20.0 7.0 24.0 10.5 30.0 13.5 60.0 15.0 70.0 18.0 75.0 18.1 95.0 21.9 95.0 22.0 10.0

質(zhì)譜條件：本文所用安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)均配備 安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源，具體離子源的 參數(shù)見(jiàn)表 3。對(duì)于采用 iFunnel 離子傳輸聚焦技術(shù) 的 Agilent 6490/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)， 高壓離子漏斗 RF 150(+)/90(-)，低壓離子漏斗 RF 60(+)/60(-)。 質(zhì)譜根據(jù)化合物的保留時(shí)間，設(shè)置時(shí)間段分別進(jìn)行 采集，時(shí)間段的設(shè)置詳見(jiàn)表 4。Delta EMV 根據(jù)所用 儀器型號(hào)分別設(shè)置，以滿(mǎn)足靈敏度的需求。為了盡 量減少樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響，HPLC 流路在分析 的前 1.8 min 和 18 min 后切換至廢液瓶。 16 種真菌毒素和 14 種同位素內(nèi)標(biāo)的 MRM 參數(shù)詳見(jiàn) 表 5。

結(jié)果與討論： UHPLC-MS/MS 條件優(yōu)化 根據(jù)每種化合物靈敏度的不同，選擇濃度為 0.5-2.0 μg/mL 的單標(biāo)溶液分別優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。真菌毒素類(lèi)化合物可能 形成 [M+H]+ 、[M+NH4] + 、[M+Na]+ 、[M-H]– 、[M+HCOO]– 和 [M+CH3COO]– 等不同形式的加合離子，各種加合離子的響 應(yīng)強(qiáng)弱與化合物本身的性質(zhì)和流動(dòng)相體系的組成有關(guān)。NIV 的 [M+H]+ 和 [M-H]– 的響應(yīng)均較弱，在含有乙酸的流動(dòng)相體 系中 [M+CH3COO]– 的響應(yīng)有非常顯著的提高；DON-3G 有同 樣的趨勢(shì)，最終我們選擇 NIV、DON、DON-3G 采用負(fù)模式 檢測(cè)，均采用 [M+CH3COO]– 為母離子。同樣在負(fù)模式下檢 測(cè)的還有 ZEN，選擇 [M-H]– 為母離子。采用正模式檢測(cè)的 真菌毒素中，15-AcDON、T-2、HT-2 選擇 [M+NH4] + 作為母 離子，其余真菌毒素選擇 [M+H]+ 為母離子。對(duì)于絕大多數(shù) 化合物來(lái)說(shuō)，正模式下噴嘴電壓設(shè)置為 0 V 時(shí)，靈敏度最 高，但對(duì)于 FB1、FB2，設(shè)置適當(dāng)?shù)膰娮祀妷悍炊鴷?huì)使響應(yīng) 提高。在本方法中 FB1、FB2 出峰的時(shí)間段，設(shè)置噴嘴電壓 為 500 V，雖然同一采集時(shí)間段的其他化合物會(huì)損失一定 的靈敏度，但響應(yīng)較低的 FB1、FB2 的響應(yīng)均可提高 50% 以 上，提高了本方法的整體檢測(cè)能力。