前言 許多金屬元素對(duì)于正常的植物生長(zhǎng)和發(fā)育非常重要。其中一種金屬元 素就是鋅，它通常是生物體中第二豐富：的過(guò)渡金屬，并且作為重要的 微量營(yíng)養(yǎng)元素在植物生理學(xué)中發(fā)揮著不同的作用。鋅是 300 多種酶的 主要成分。它負(fù)責(zé)基因調(diào)控和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，包括鋅指、鋅簇和 RING 指結(jié)構(gòu)域。鋅還參與光合作用和 CO2 固定等基本過(guò)程。植物中 的鋅過(guò)量或缺乏將導(dǎo)致植物死亡率高、生長(zhǎng)遲緩和萎縮、萎黃病、壞 死、小葉病和開(kāi)花延遲。所有這些癥狀都可能對(duì)食品安全產(chǎn)生嚴(yán)重影 響，因?yàn)榕c鋅可利用性相關(guān)的作物產(chǎn)量將顯著降低 [1-3]。

通過(guò)鑒定植物汁液中存在的低分子量含金屬化合 物，有助于更深入地了解植物生理學(xué)，并且確定其 準(zhǔn)確的功能，這將進(jìn)一步促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境研 究。然而，復(fù)雜生物基質(zhì)如植物樣品的研究可能在 樣品前處理或色譜分離過(guò)程中存在若干問(wèn)題。主要 的挑戰(zhàn)與金屬配合物的低濃度及其多樣性有關(guān)。此 外，金屬配合物通常不穩(wěn)定，能夠在萃取、離線預(yù) 濃縮步驟、甚至色譜分離中發(fā)生降解。在迄今為止 所研究的色譜技術(shù)中，體積排阻色譜 (SEC)、親水 相互作用色譜 (HILIC) 和反相 (RP) 色譜已被證明是 適合避免金屬配合物在分析過(guò)程中發(fā)生降解的技 術(shù) [4]。由預(yù)濃縮柱和 HILIC 或 RP 分離柱組成的色 譜系統(tǒng)似乎是此類(lèi)應(yīng)用的理想選擇。 本研究提出一種 ICP-MS 輔助的金屬組學(xué)方法用于 分離豌豆后韌皮部中存在的鋅形態(tài)分析。通過(guò)具有 在線預(yù)濃縮功能的毛細(xì)管 HPLC-ICP-MS 對(duì)胚囊液體 進(jìn)行分析。由于植物汁液量非常少，所以需要使用 毛細(xì)管色譜

實(shí)驗(yàn)部分：樣品 本文對(duì)來(lái)自發(fā)育中的豌豆豆莢（嫩豌豆）的胚囊液 體（后韌皮部）進(jìn)行了研究。 樣品前處理 用玻璃毛細(xì)管在豆莢中穿孔，使用蠕動(dòng)泵提取液體 胚乳，將其放入保存在冰上的 Eppendorf 管中。收 集完成后，立即將樣品置于液氮中冷凍，并在進(jìn) 一步分析之前將其置于 -20 °C 的溫度下儲(chǔ)存。在分 析之前，將樣品解凍，并用乙腈按 1:2 的比例（樣 品：乙腈）進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笤?10000 rpm 的轉(zhuǎn)速下 離心 2 分鐘。收集上清液并立即進(jìn)行分析。

HPLC-ICP-MS等離子體質(zhì)譜系統(tǒng) 使用配備毛細(xì)管泵和手動(dòng)進(jìn)樣閥（定量環(huán)尺寸： 100 µL）的 Agilent 1100 液相色譜儀。將 30 µL 上清 液進(jìn)樣至 SeQuant 兩性離子型 (ZIC-) HILIC 保護(hù)柱 （Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 5 mm × 1 mm（內(nèi) 徑），5 µm）中，使用 90% 乙腈和 10 mM 甲酸銨緩 沖液 (pH 5.5) 進(jìn)行等度洗脫 (20 µL/min)。用流動(dòng)相 將樣品清洗 4 min，然后反沖至用于化合物分離的 SeQuant ZIC-HILIC 毛細(xì)管柱（Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 150 mm × 0.3 mm（內(nèi)徑），3.5 µm）。使用 洗脫液 A（10 mM 甲酸銨緩沖液 (pH 5.5)）和洗脫液 B（乙腈），進(jìn)行流速為 4 μL/min 的梯度洗脫。

使用含有 20 ppb Y、Li、Tl、Ce 溶于 2% 硝酸中的 調(diào)諧溶液，在每天開(kāi)始時(shí)自動(dòng)對(duì) ICP-MS條件進(jìn)行 優(yōu)化。7700x 的 ORS3 碰撞/反應(yīng)池在高能量氦模式 下操作，以排除可能出現(xiàn)于 Zn 同位素中的多原子 干擾。使用 60 ms 的駐留時(shí)間采集 64Zn 和 66Zn 的信 號(hào)。ICP-MS 操作條件見(jiàn)表 2。

結(jié)果與討論 獲得的嫩豌豆后韌皮部的 64Zn 的色譜圖如圖 2 所 示。使用具有在線預(yù)濃縮功能的毛細(xì)管 ZIC-HILIC ICP-MS 使我們能夠獲得尖銳的高強(qiáng)度色譜峰，并對(duì) 兩種鋅形態(tài)進(jìn)行分離和檢測(cè)（圖 2a 和 2b）。使用 ESI Orbitrap MS/MS 鑒定兩種金屬配合物。ICP-MS 檢測(cè)對(duì)于測(cè)定不同鋅形態(tài)的保留時(shí)間和估計(jì)質(zhì)量平 衡至關(guān)重要。這簡(jiǎn)化了在 ESI-MS 質(zhì)譜圖中搜索鋅 配合物的步驟。質(zhì)譜圖的放大部分（圖 2d 和 2e） 清晰地顯示了兩種包含鋅的同位素模式的離子。這 些提取離子色譜圖 (EIC) 的保留時(shí)間與通過(guò)毛細(xì)管ZIC-HILIC ICP-MS 觀察到的兩個(gè)鋅的峰（圖 2c）具有 良好的一致性。獲得的數(shù)據(jù)使我們能夠鑒定兩種鋅 配合物：鋅-煙草胺 (NA) 和鋅-(組氨酸)2（表 3）。

由毛細(xì)管 HPLC 和 ICP-MS 組成的色譜系統(tǒng)使我們獲 得的 64Zn（約 6 fmol 的 Zn-NA 配合物）的檢測(cè)限為 75 ng/L，該檢測(cè)限是由基線上 20 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 3 倍計(jì)算得到。將該數(shù)值與 Zn-NA 配合物的信號(hào)進(jìn) 行比較，所獲得的 64Zn 的色譜柱回收率為 70-80%。

結(jié)論 ：本研究展示了一種有效的 ICP-MS 輔助的金屬組學(xué) 方法，用于分離和鑒定存在于豌豆后韌皮部中的 鋅配合物。使用 ZIC-HILIC 預(yù)柱對(duì)鋅形態(tài)進(jìn)行預(yù)濃 縮，然后通過(guò) ZIC-HILIC 毛細(xì)管柱進(jìn)行分離。通過(guò) 毛細(xì)管 HPLC 與 ICP-MS 和 ESI MS/MS 儀器聯(lián)用獲 得的數(shù)據(jù)組合可用于鑒定不同的鋅配合物。由于植 物汁液量非常少，所以需要使用毛細(xì)管色譜。另 外，具有在線預(yù)濃縮功能的色譜系統(tǒng)非常適用于分 析包含低濃度金屬形態(tài)（其有時(shí)也不穩(wěn)定）的生物 樣品。本方法已成功用于鑒定兩種鋅形態(tài)：鋅-煙 草胺 (NA) 和鋅-(組氨酸)2 配合物，證明 NA 和組氨 酸是嫩豌豆后韌皮部中的兩種與鋅形成配合物的主 要配體。