摘要：復(fù)雜生物樣品的高效提取、凈化和分析對法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室極為有益。磷脂 (PPL) 已被確定為在全血中四氫da麻酚 (THC) 及其代謝物的 LC-MS/MS 分析中引起基質(zhì)效應(yīng)的主要來源。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了全血中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 - THC (THC-OH) 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC (THC-COOH) 的提取和 LC-MS/MS 分析。樣品前處理中采用孔內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀法 (PPT) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 直通 1 mL 過濾柱去除 PPL。Captiva EMR-Lipid 能夠得到更潔凈的洗脫液，去除全血基質(zhì)中 97% 以上不需要的 PPL，且目標(biāo)分析物的回收率高于 92%。對 1 ng/mL THC、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形，并獲得了良好的信噪比 (S/N)。在 0.5 至 100 ng/mL 范圍內(nèi)獲得的響應(yīng)呈線性，R2 高于 0.99。獲得的定量限在 1.0 ng/g 以下，RSD 小于 11.5%。在三天的實(shí)驗(yàn)過程中，得到的結(jié)果一致。

前言：在法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，LC-MS/MS 分析之前高效的樣品前處理是一個(gè)重要考慮因素。樣品前處理可用于減少系統(tǒng)污染并改善數(shù)據(jù)完整性、方法選擇性、分析靈敏度和可靠性。全血中存在的兩種主要干擾物為是蛋白質(zhì)和磷脂 (PPL)。PPL 已被確定為 LC-MS/MS 生物分析中引起基質(zhì)效應(yīng)的主要來源，因?yàn)樵陔妵婌F電離 (ESI) 期間所形成的液滴表面上會(huì)發(fā)生競爭電離1 。常用的法醫(yī)學(xué)樣品前處理技術(shù)包括蛋白質(zhì)沉淀 (PPT)、固相萃取 (SPE)、液液萃取 (LLE) 和介質(zhì)液液萃取 (SLE)。每種技術(shù)在速度、成本和生成數(shù)據(jù)的質(zhì)量方面各有優(yōu)劣。例如，PPT、 LLE 和 SLE 無法去除 PPL，而 SPE 執(zhí)行起來更耗時(shí)且更復(fù)雜2 。然而，在這些技術(shù)中，PPT 得到了廣泛的認(rèn)可。PPT 以規(guī)定的比例向生物樣品中加入有機(jī)沉淀溶劑（如乙腈 (ACN) 或甲醇 (MeOH)），可輕松高效地除去蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)的變性，它們形成的沉淀可通過過濾或離心得以去除。但 PPT 無法去除 PPL，因?yàn)?PPL 能夠溶于有機(jī)沉淀溶劑中。大麻物質(zhì)類是支持案件調(diào)查的法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常見的目標(biāo)分析物之一?？焖佟?zhǔn)確地確認(rèn)并定量生物樣品中的 ?9 -THC (THC) 及其主要代謝物 11-羥基-?9 -THC (THC-OH) 和 11-nor9-?9 -羧基-THC (THC-COOH) 至關(guān)重要。然而，THC 及其代謝物在樣品前處理過程中容易發(fā)生非特異性結(jié)合。迫切需要一種全血樣品前處理方法，在減少樣品前處理步驟（包括離線 PPT、離心、轉(zhuǎn)移和稀釋）的同時(shí)實(shí)現(xiàn)簡化的孔內(nèi) PPT 和 PPL 去除。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了一種借助 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 過濾柱去除干擾物質(zhì)（特別是 PPL）的方法，該方法采用簡單的直通形式，不會(huì)引起分析物損失。所得的提取物更潔凈，減少了潛在的離子抑制以及色譜柱和質(zhì)譜儀污染。

依次使用孔內(nèi) PPT 和 Captiva EMR-Lipid 過濾柱去除 PPL，對全血中的 THC、THC-OH 和 THC-COOH 進(jìn)行提取。隨后使用 Agilent 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。對 PPL 去除率進(jìn)行了評估。還測定了 THC 及其代謝物的日間（3 日）準(zhǔn)確度、精密度和回收率。有關(guān)血漿樣品的分析，請參見安捷倫應(yīng)用簡報(bào)使用 Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 對人血漿中的 THC 和代謝物進(jìn)行高效定量分析3 。

實(shí)驗(yàn)部分：試劑與化學(xué)品 ?9 -THC、11-羥基-?9 -THC、11-nor-9-?9 -羧基-THC、?9 - THC-d3、11-羥基-?9 -THC-d3 和 11-nor-9-羧基-?9 -THC-d9 購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)。LC-MS/MS 級(jí)甲酸銨同樣購自 Sigma-Aldrich。所有溶劑均為液相色譜級(jí)或更高級(jí)別，均購自 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA)。溶液在甲醇中配制濃度為 10 µg/mL 的 THC 及其代謝物 THC-OH 和 THC-COOH 的混標(biāo)工作溶液。將氘代 THC-d3、THC-OH-d3 和 THC-COOH-d9 混合到工作溶液中，濃度為 10 µg/mL（溶于甲醇中），并用作內(nèi)標(biāo) (IS)。校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)量控制樣品在預(yù)加標(biāo)質(zhì)量控制 (QC) 樣品中加入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行配制七份。QC 樣品為低濃度 QC (LQC)、中等濃度 QC (MQC) 和高濃度 QC (HQC)，分別對應(yīng)于全血中 1、10、 50 ng/mL 的濃度。在每種濃度的 QC 樣品中，添加濃度為 50 ng/mL 的氘代混標(biāo)溶液 (IS)。在經(jīng)過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質(zhì)中，用 THC 及其代謝物的工作溶液后加標(biāo)，其加標(biāo)濃度分別對應(yīng)于全血中 1、 10、50 ng/mL 的濃度。另外，還加入一份 5 µL 的 1.0 µg/mL IS 溶液?；|(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制得。對經(jīng)過 Captiva EMR-Lipid 凈化的空白基質(zhì)進(jìn)行后加標(biāo)，加標(biāo)濃度對應(yīng)于提取物中 0.5、1、5、10、50、100 ng/mL 的濃度。在每種濃度的校準(zhǔn)標(biāo)樣中加入 5 µL 1.0 µg/mL IS。

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結(jié)果與討論：去除不需要的脂質(zhì)基體 EMR-Lipid 方法簡便，通用于極性、中等極性和非極性的目標(biāo)物分析，可消除基質(zhì)效應(yīng)并改善分析物回收率。EMR-Lipid 利用*的吸附劑化學(xué)作用，用水活化 EMR-Lipid 吸附劑后，能通過體積排阻和疏水性相互作用選擇性捕集脂類（圖 2）。脂類上的無支鏈烴鏈進(jìn)入吸附劑中，而體積較大的分析物并不進(jìn)入其中。然后，進(jìn)入吸附劑中的脂鏈通過疏水相互作用被捕集。PPL 是細(xì)胞膜的主要成分，大量存在于全血中。PPL 是由磷酸酯和膽堿單元組成的親水性頭部基團(tuán)以及由長鏈烷基組成的疏水性尾部構(gòu)成。