摘要： Agilent Captiva 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品 (EMR-Lipid) 是第二代 EMR-Lipid 產(chǎn)品，采用便捷的 SPE 過濾柱或 96 孔板。本研究展示了采用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板對人全血中的 24 種代表性濫用藥進(jìn)行 LC/MS/MS 定量測定。樣品的前處理方法為：采用孔內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀法 (PPT) 去除蛋白質(zhì)，然后采用 Captiva EMR-Lipid 凈化產(chǎn)品去除脂類。通過以下方式對該方案進(jìn)行改進(jìn)：首先加入全血樣品，然后加入沉淀溶劑以促進(jìn)實(shí)現(xiàn)*的孔內(nèi) PPT。整個(gè)樣品處理在 96 孔板中作為一個(gè)批次執(zhí)行，并通過離心或正壓歧管完成樣品洗脫。整個(gè)過程簡單、快速，能夠在兩小時(shí)內(nèi)完成 96 個(gè)樣品的前處理。高效基質(zhì)凈化產(chǎn)品使磷脂去除率高于 99%，從而減小了基質(zhì)離子抑制效應(yīng)和系統(tǒng)污染。通過為期三天的準(zhǔn)確度和精度運(yùn)行對定量方法進(jìn)行驗(yàn)證，在所有加標(biāo)濃度下均獲得了優(yōu)異的準(zhǔn)確度 (100±20%) 和精度 (RSD < 15%)，全血中的定量限 (LOQ) 為 0.1–0.5 ng/mL，且線性校準(zhǔn)曲線的 R2 高于 0.995。結(jié)果表明，采用孔內(nèi) PPT 和 Captiva EMR-Lipid 凈化產(chǎn)品建立的方案顯著改善了人全血中濫用藥化合物定量測定結(jié)果的可靠性。

前言：在法醫(yī)毒理學(xué)中，對快速可靠地篩查和定量測定生物樣本中的濫用藥 (DoA) 的需求正在不斷增加1–3，主要原因是濫用藥以及提交分析的樣品數(shù)量日益增多。過去，選擇尿液樣品進(jìn)行篩查和鑒定。但是，必須對這些藥物的代謝物進(jìn)行鑒定，由此增加了定量檢測的復(fù)雜度和不確定性。血液樣品（包括全血、血漿和血清）的分析日益重要。初，血漿是定量分析選擇的主要樣品基質(zhì)，但是隨著樣品前處理和儀器檢測技術(shù)的改進(jìn)，全血已成為鑒定和定量分析的基質(zhì)。與尿液相比，使用血液作為樣品進(jìn)行分析具有若干項(xiàng)優(yōu)勢。 • 首先，這種技術(shù)能夠在體內(nèi)代謝和過濾之前立即檢測藥物 • 其次，因?yàn)樯韰?shù)變化的范圍非常窄，血液相對均勻 • 再次，幾個(gè)歐洲國家和美國一些地區(qū)要求毒駕 (DUID) 測試采用血液樣品4 因此，可靠地定量測定血液基質(zhì)（尤其是全血）中的 DoA 對于常規(guī)毒理學(xué)分析非常重要。目前使用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) (GC/MS) 和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) (LC/MS/MS) 對 DoA 進(jìn)行毒理學(xué)檢測。然而，GC/MS 方法通常很耗時(shí)，并且通常需要在分析之前對分析物進(jìn)行化學(xué)衍生5 。 LC/MS/MS 分析技術(shù)的優(yōu)勢在于檢測速度更快，且具有更高的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性6 。用于系統(tǒng)毒理學(xué)分析的樣品前處理方法包括液液萃取 (LLE)、固相萃取 (SPE) 和固相支持液液萃取 (SLE)。這些方法費(fèi)力費(fèi)時(shí)，并需要使用大量有毒溶劑。安捷倫增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品 (EMR-Lipid) 吸附劑是一種新型吸附材料，能夠選擇性去除樣品基質(zhì)中的主要脂類且不會造成分析物損失。EMR-Lipid 吸附劑提供的脂質(zhì)去除機(jī)制是基于脂質(zhì)化合物與這種*的吸附劑之間的體積排阻和疏水作用。這種相互作用機(jī)制能夠在 PPT 之后從生物體液中高選擇性且高效地去除磷脂及其他脂類。第二代 EMR-Lipid 吸附劑以 SPE 過濾柱/板形式包裝，只需使樣品通過吸附劑即可完成凈化。研究表明，使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板進(jìn)行孔內(nèi) PPT，隨后進(jìn)行流通式凈化，能夠有效去除生物體液中的磷脂，并實(shí)現(xiàn)人血清中代表性藥物的定量測定7,8。為證明 Captiva EMR-Lipid 96 孔板對于法醫(yī)學(xué)檢測的可行性，本研究選擇 24 種常見的 DoA 化合物。表 1 列出了所選化合物的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)。使用為期三天的準(zhǔn)確度和精度測試以及基質(zhì)凈化評估對方法進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)部分：試劑與化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或分析純級。乙腈 (ACN) 購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。試劑級甲酸 (FA) 來自安捷倫（部件號 G2453-85060）。乙酸銨和氫氧化銨購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)?；旌?DoA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 µg/mL，溶于甲醇 (MeOH) 中）來自安捷倫（部件號 5190-0470-1）。人全血樣品來自 Biological Specialty Corp. (Colmar, PA, USA)。內(nèi)標(biāo) (IS) 儲備液（1 mg/mL，溶于 MeOH 或 ACN 中）購自 Cerilliant (Round Rock, TX, USA)。標(biāo)樣和溶液利用混合 DoA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和單獨(dú)的 IS 儲備液配制標(biāo)樣和 IS 加標(biāo)溶液。在 20:80 甲醇/水中配制濃度為 200 ng/mL 的標(biāo)樣加標(biāo)溶液，用于對校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)量控制 (QC) 樣品加標(biāo)。用 20:80 甲醇/水將單獨(dú)的 IS 儲備液稀釋至 2 µg/mL，制得 IS 加標(biāo)溶液，并將該 IS 加標(biāo)溶液直接加入樣品中。將 385.3 mg 乙酸銨溶于 1 L Milli-Q 水中，然后加入 1 mL 甲酸 (FA)，制得含 0.1% FA 的 5 mmol/L 乙酸銨緩沖液，作為流動相 A。將 1 mL FA 加入 1 L 乙腈中，制得含 0.1% FA 的乙腈溶液，作為流動相 B。將 400 µL NH4OH 加入 40 mL 預(yù)混合的 95:5 ACN/MeOH 中，新鮮配制溶于 95:5 ACN/MeOH 中的 1% 氫氧化銨 (NH4OH) 溶液。該溶液在使用前保存于 –20 °C 下。

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結(jié)論在人全血中 24 種代表性 DoA 化合物的定量測定中，對一種使用蛋白質(zhì)沉淀和 Captiva EMR-Lipid 凈化產(chǎn)品的樣品前處理方法進(jìn)行了驗(yàn)證。為期三天的準(zhǔn)確度和精度運(yùn)行結(jié)果證明，該方法提供了優(yōu)異且緊湊的校準(zhǔn)曲線線性、優(yōu)異的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精度以及可接受的分析物回收率和基質(zhì)效應(yīng)。Captiva EMR-Lipid 凈化產(chǎn)品使全血基質(zhì)中的磷脂獲得了優(yōu)異的去除率。在孔內(nèi) PPT 過程中，首先加入全血樣品，然后加入沉淀溶劑，由此改善了樣品混合均勻性并促進(jìn)蛋白質(zhì)*沉淀。采用 96 孔板形式開發(fā)的方案適用于高通量實(shí)驗(yàn)室對快速、可自動化的樣品前處理方法的需求，便捷的孔內(nèi) PPT 和 EMR-Lipid 凈化產(chǎn)品簡化了工作流程，同時(shí)仍可提供高效的樣品提取和基質(zhì)凈化。更干凈的分析樣品還可縮短清洗儀器檢測系統(tǒng)所需的時(shí)間，改善樣品檢測通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量。