摘要:蛋白質(zhì)沉淀技術(shù) (PPT) 是適于 LC/MS/MS 分析的生物體液樣品前處理的常用技術(shù)之一。將蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)用于生物體液樣品，可以從基質(zhì)中有效去除蛋白質(zhì)。本應(yīng)用簡報討論了生物體液樣品 PPT 的重要步驟、考慮因素和注意事項。本文重點介紹使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板的孔內(nèi) PPT，包括合適的沉淀溶劑、比例、添加劑、生物體液基質(zhì)、生物體液樣品等分和沉淀溶劑的板上添加順序、內(nèi)標(biāo) (IS) 添加，以及板中的樣品混合。后，對使用離心的傳統(tǒng) PPT 和用 Captiva EMR-Lipid 凈化后 PPT 的對比結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)討論，包括時間、方法性能以及對儀器的影響。

前言蛋白質(zhì)沉淀 (PPT) 已廣泛用于 LC/MS/ MS 分析的生物體液樣品前處理1 。將生物體液樣品與 3–5 倍體積可與水混溶的溶劑（如乙腈 (ACN)、甲醇 (MeOH) 或二者的混合物）混合，來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效去除。有機(jī)溶劑的添加破壞了蛋白質(zhì)的水化層，降低了蛋白質(zhì)分子間的排斥力，顯著降低了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使蛋白質(zhì)沉淀出來。之后，可通過離心或過濾去除沉淀，并將上清液用于分析。即使由于蛋白質(zhì)結(jié)合或受蛋白質(zhì)結(jié)合影響的分析物穩(wěn)定性，導(dǎo)致某些目標(biāo)分析物可能發(fā)生損失，PPT 方法學(xué)仍然提供了快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的樣品前處理方法，適用于高通量樣品分析。 Captiva EMR-Lipid 96 孔板可以進(jìn)行孔內(nèi) PPT，然后進(jìn)行高效過濾以去除沉淀。此外，EMR-Lipid 吸附劑可在樣品過濾期間與基質(zhì)中的脂類發(fā)生相互作用，得到更潔凈的洗脫液，同時去除了蛋白質(zhì)和脂類。本應(yīng)用簡報重點討論了使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板的這一重要樣品前處理技術(shù)的關(guān)鍵步驟。

沉淀溶劑與比例可與水混溶的有機(jī)溶劑通用于沉淀蛋白質(zhì)，通常是 ACN、MeOH 或二者的混合物1 。之前的研究中對采用 ACN 或 MeOH 的 PPT 進(jìn)行了全面對比2 。使用 ACN 進(jìn)行 PPT 通常會產(chǎn)生大量黃色凝結(jié)沉淀，而 MeOH 通常會產(chǎn)生更細(xì)的白色凝結(jié)沉淀（圖 1）。上清液的澄清度通常是 PPT 效率的良好指標(biāo)，渾濁的上清液表明仍然存在未沉淀的蛋白質(zhì)。圖 1A 表明，使用 MeOH 和 ACN 的小沉淀比分別為 3:1 和 2:1 時，可以獲得澄清的上清液。

圖 1B 表明，樣品在 10 °C 下儲存 24 小時后，以 3:1 的比例使用 ACN 可獲得澄清的上清液。結(jié)果清晰表明，ACN 可比 MeOH 實現(xiàn)更有效的蛋白質(zhì)沉淀，如需實現(xiàn)有效的蛋白質(zhì)去除，有必要將小沉淀比設(shè)為 3:1。然而，更大的沉淀比也會導(dǎo)致樣品更多的稀釋。因此，通常推薦采用 3:1–5:1 的沉淀比，在實現(xiàn)有效蛋白質(zhì)去除的同時仍保持樣品的適當(dāng)稀釋

沉淀溶劑的另一個考慮因素是目標(biāo)分析物的溶劑萃取。ACN 和 MeOH 可對不同化合物表現(xiàn)出不同的萃取能力。在需要調(diào)節(jié)目標(biāo)分析物的溶劑可萃取性時，可以添加少部分的 MeOH（通常為 5%–15%）。而需要了解的是，即使沉淀溶劑中如此少量的 MeOH，也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀呈現(xiàn)出不同的視覺效果（圖 2A 和圖 2B）。與沉淀溶劑混合的 MeOH 越多，沉淀就越細(xì)，過濾去除沉淀時所需的壓力也就越大。鑒于 MeOH 的蛋白質(zhì)沉淀效率低于 ACN，過量 MeOH 會對 PPT 效率產(chǎn)生不利影響。因此，建議沉淀溶劑中的 MeOH 含量不超過 15%。使用 ACN（或主要是 ACN）作為沉淀溶劑的第三點考慮因素應(yīng)是易于通過過濾去除蛋白質(zhì)沉淀。采用 ACN 的 PPT 可產(chǎn)生較大顆粒的蛋白質(zhì)沉淀，這種沉淀不易堵塞濾芯/濾膜，可更輕松地過濾沉淀。采用 MeOH 的 PPT 可產(chǎn)生更多更細(xì)的沉淀，這種沉淀易于堵塞濾芯/濾膜，因此過濾時需要明顯更大的壓力。

為減少蛋白質(zhì)結(jié)合，通常將甲酸 (FA) 或氫氧化銨 (NH4OH) 等添加劑加入沉淀溶劑中，其中 1% FA 是常用的添加劑。而在全血 PPT 中，應(yīng)謹(jǐn)慎添加酸，因為酸可以提取出更多的血紅蛋白顏色，PPT 后會得到棕色/紅色上清液。圖 2C 和圖 2D 顯示采用中性沉淀溶劑、酸化溶劑（含 1% FA）和堿性溶劑（含 1% NH4OH) 進(jìn)行 PPT 后的上清液外觀。酸化 PPT 的上清液呈深棕色/紅色。因此，請仔細(xì)考慮或避免使用酸化沉淀溶劑來進(jìn)行全血 PPT。

生物體液生物體液包括全血、血漿、血清、尿液和其他體液。全血、血漿和血清是富含蛋白質(zhì)的主要血液基質(zhì)。因此，在 LC/MS/MS 分析之前有效去除這些蛋白質(zhì)至關(guān)重要。 • 全血是含有抗凝血劑的血液，不會分離為液體部分和血細(xì)胞 • 血清是無抗凝劑時與血細(xì)胞分離的頂層澄清液體部分，因此血清中不含纖維蛋白原 • 血漿是與血細(xì)胞分離的液體部分，含有纖維蛋白原在相同體積下，基質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量遵循全血 > 血漿 > 血清，如 PPT 生成的蛋白質(zhì)沉淀所示（圖 3）。通常認(rèn)為尿液和其他體液是低蛋白質(zhì)含量基質(zhì)，PPT 仍可廣泛用于這類基質(zhì)，但與血液基質(zhì)相比，這類基質(zhì)實現(xiàn)有效蛋白質(zhì)去除的難度不大。因此，這類生物體液基質(zhì)中采用的沉淀溶劑與沉淀比有更大的靈活性。通常，用于制備這類樣品基質(zhì)的 PPT 被稱為稀釋和上樣。

Captiva EMR-Lipid 板上的孔內(nèi) PPT 高通量批處理中可自動進(jìn)行 PPT；因此，96 孔板形式得到廣泛采用。在過濾型沉淀去除中，孔內(nèi) PPT 有利于簡化工作流程。而避免由沉淀造成的堵塞對過濾非常重要。Agilent Captiva 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除 EMR-Lipid (EMR-Lipid) 吸附劑可在蛋白質(zhì)沉淀后，高選擇性而有效地去除生物體液中的磷脂和其他脂類。這款產(chǎn)品同時采用了深度過濾機(jī)制的設(shè)計，可實現(xiàn)無堵塞的高效蛋白質(zhì)沉淀過濾，從而可以使用孔內(nèi) PPT 并簡化工作流程。

血液基質(zhì)（特別是全血）是高粘度液體。之前建議將血清或血漿樣品加入 EMRLipid 板的沉淀溶劑中3,4。而將這一方法應(yīng)用于全血樣品，就會出現(xiàn)問題。全血的高粘度使其容易立即沉降在底部，導(dǎo)致樣品混合均勻性過低。一小部分未沉淀的全血可能會流經(jīng) EMR-Lipid 過濾柱，造成樣品間的顯著差異。有效混合有助于實現(xiàn)*的蛋白質(zhì)沉淀5 。而對于 96 孔板中的全血樣品，由于產(chǎn)生大量沉淀、沉淀堵塞槍頭的高風(fēng)險以及孔間交叉污染，使樣品抽吸混合較為困難。

結(jié)論 PPT 因其簡便性和適用性，廣泛用于制備 LC/MS/MS 分析的生物體液樣品。使用 96 孔板形式的批處理提高了樣品前處理效率，而得到廣泛使用。孔內(nèi) PPT + Captiva EMR-Lipid 凈化技術(shù)與傳統(tǒng) PPT 相比具有許多優(yōu)勢，包括簡化的工作流程、蛋白質(zhì)和脂類的同時去除，更高的方法可靠性、高質(zhì)量數(shù)據(jù)以及對檢測儀器更少的影響。根據(jù)分析要求，使用合適的沉淀溶劑類型、比例和添加劑至關(guān)重要。合適的溶劑和樣品添加順序（樣品、IS 和沉淀溶劑）是達(dá)到有效均勻混合并防止繞過樣品的重要因素。與傳統(tǒng)的單個樣品處理相比，96 孔板上的批處理通常具有更高的交叉污染風(fēng)險；因此，適當(dāng)?shù)囊埔汉突旌鲜株P(guān)鍵。