摘要：本應(yīng)用簡報介紹了 mAb 產(chǎn)品中亞 ppm 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)雜質(zhì)的定量分析方法。本工作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 平臺、Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)和 Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)。

前言：宿主細(xì)胞蛋白 (HCP) 雜質(zhì)是低濃度的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，來源于生物藥物生產(chǎn)過程中的宿主生物。由于它們可能影響產(chǎn)品安全性和功效，因此根據(jù)法規(guī)要求必須對藥品中的 HCP 進行監(jiān)測和控制[1]。傳統(tǒng)上，酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 是定量分析蛋白質(zhì)治療藥物中 HCP 的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，ELISA 的特異性和覆蓋率不足以鑒定并定量分析各種 HCP。因此，LC/MS 技術(shù)成為 HCP 分析的另一選擇。在 HCP 的 LC/MS 定量分析過程中，主要挑戰(zhàn)在于低豐度 HCP 肽段與高豐度藥品肽段的共洗脫。因此需要在藥品基質(zhì)的高背景下對低豐度肽進行靈敏而可重現(xiàn)的定量分析。

本應(yīng)用簡報介紹了用于宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)高靈敏度定量分析的完整工作流程解決方案，

包括：

• 用于樣品自動前處理的 Agilent AssayMAP Bravo 平臺 • 用于樣品分離的 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜儀

• 用于數(shù)據(jù)采集的 Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)

• 用于 MRM 方法開發(fā)的 Skyline 軟件中的安捷倫自動化工具

• 使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件和 Skyline 軟件進行數(shù)據(jù)處理使用基于多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 的同位素稀釋方法，結(jié)果顯示可準(zhǔn)確定量低至亞 ppm (ng/mg) 濃度的 HCP。

實驗部分儀器 • Agilent AssayMAP Bravo 系統(tǒng) (G5571AA) • Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)包括： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備樣品冷卻裝置選件（選件 100） • Agilent 1290 Infinity II 柱溫箱 (G7116B) • Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng) • 安捷倫噴射流 ESI 離子源 (G1958-65138)

材料：人 IgG1 mAb（來自合作伙伴的一種研發(fā)產(chǎn)品）由中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞產(chǎn)生，并經(jīng)過 Protein A 純化。重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記 (SIL) 肽標(biāo)準(zhǔn)品由第三方供應(yīng)商定制合成（表 1）。所有 SIL 肽經(jīng) HPLC 純化，質(zhì)量通過 LC/MS 和氨基酸分析測定。

樣品前處理使用 AssayMAP Bravo 系統(tǒng)進行 mAb 樣品變性、還原、烷基化和胰蛋白酶解。將 SIL 肽以等摩爾濃度混合，并以 8 種不同濃度（每種 SIL 肽濃度為 6.25、 12.5、25、62.5、125、250、12500、 125000 amol/µg）加入樣品酶解物中，用于定量分析。

LC/MS 分析：使用 9 分鐘液相色譜梯度，通過 6495C 三重四極桿 LC/MS 在 dMRM 模式下分析樣品。表 1 和表 2 詳細(xì)列出了色譜和質(zhì)譜分析的實驗條件。使用與 Skyline 和 Agilent MassHunter 工作站軟件集成的安捷倫自動化工具對 LC-dMRM 方法進行自動優(yōu)化。