摘要：本文介紹了采用配置 APCI 源的 Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，同時檢測沙坦 藥物中六種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì) NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA 的 方法。該方法涵蓋了歐美藥檢系統(tǒng)截止到 2019 年 11 月提到的全部亞硝胺類基因毒性雜 質(zhì)，操作簡單、特異性高，且靈敏度滿足目前*，適用于沙坦類原料藥和部分制劑 中 6 種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的快速篩查和準(zhǔn)確定量。

前言：2018 年 7 月，纈沙坦原料藥被曝出含有亞硝胺類基因毒性雜質(zhì) N-亞硝基二jia胺 (NDMA)， 9 月份，該類藥物又曝出含有另一種亞硝胺類雜質(zhì) N-亞硝基二乙胺 (NDEA)。2019 年 3 月，第三種亞硝胺類雜質(zhì) N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA) 在氯沙坦鉀中檢出超標(biāo)[1]。 沙坦類降壓藥的全名是“血管緊張素受體阻斷劑”(ARB)。由于此類藥物都帶有“沙坦” 二字，因此俗稱“沙坦類降壓藥”，是目前治療高血壓的一線降壓藥，使用廣泛。亞硝胺 (Nitrosamine) 是一類通式為 R1 N(–R2 )–N=O 的胺化合物，結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，其大部分成 員都屬于強致癌物。根據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單，從沙坦類降 壓藥中發(fā)現(xiàn)的 NDEA、NDMA 屬于 2A 類致癌物，即“對人很可能致癌，此類致癌物對人 致癌性證據(jù)有限，對實驗動物致癌性證據(jù)充分”[2]。另外，根據(jù) FDA 的初步評估，NMBA 暴露風(fēng)險與 NDMA 相同[1]。

目前，關(guān)于沙坦類藥物中亞硝胺的檢測，可以在上查到歐洲 OMCL 實驗室和 FDA 公布的 GC/MS、LC 和 LC/MS 方法。其中， FDA 在 2019 年 8 月公布了 LC-HRMS 方法和 RapidFire-MS/MS 方法[3, 4]，對沙坦類藥物中可能含有的 6 種亞硝胺類基因毒性雜 質(zhì)進行篩查和半定量分析。FDA 提出，除先前檢出的 NDEA、 NDMA 和 NMBA 以外，根據(jù)文獻報道和工藝研究，還有三種亞 硝胺類雜質(zhì)可能存在于 ARB 藥物中，分別是 N-亞硝基乙基異丙 基胺 (N-nitrosoethylisopropylamine, NEIPA)、N-亞硝基二異丙 基胺 (N-nitrosodiisopropylamine, NDIPA) 和 N-亞硝基二丁基胺 (N-nitrosodibutylamine, NDBA)。鑒于 LC-HRMS 和 RapidFire-MS/MS 配置比較特殊，且無法用于準(zhǔn)確定量分析，我們參考 FDA 方法， 開發(fā)出采用常規(guī) LC-APCI-QQQ 配置同時檢測沙坦藥物中 6 種亞硝 胺類基因毒性雜質(zhì)的方法。所開發(fā)的方法操作簡單、特異性高， 且靈敏度滿足目前*。

實驗部分：試劑和樣品 甲醇為質(zhì)譜級，甲酸為色譜級，購于 Merck；所用實驗用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；6 種亞硝胺 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品由合作用戶提供。

儀器和設(shè)備：采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜系統(tǒng)與 6470三重四 極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)配備如下：二元泵（部件號 G7120A）、自動進樣器（部件號 G7167B）、柱溫箱（部色譜柱選用 Agilent InfinityLab Poroshell PFP（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號 695775-408）。如果沙坦類樣品色譜保留較強 （如纈沙坦和厄貝沙坦），也可以用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號 695775-902）進行 分離。件號 G7116B）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取 6 種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇超聲溶解，并定量稀釋制成 每 1 mL 中約含 10 mg 目標(biāo)化合物的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用水逐 級稀釋成每 1 mL 中分別包含約 0.1、0.5、1、5、10、50、100、 500、1000 ng 目標(biāo)化合物的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品線性系列溶液。線 性范圍和相關(guān)濃度點可根據(jù)檢測需要自行調(diào)整。

樣品前處理：將 100 mg 沙坦類樣品研磨后，溶于 10 mL 水中，用超聲提取 10 分鐘，過濾后分析。 對于水溶性欠佳的沙坦樣品，先用大約 2 mL 甲醇溶解后，經(jīng)超聲 提取后，用水稀釋到 10 mL，再次超聲提取 10 分鐘，濾除沉淀后 進行分析。終濃度以 API 計為 10 mg/mL。

結(jié)果與討論：色譜分離結(jié)果 本文參考 FDA 方法，基于窄內(nèi)徑 Poroshell 系列色譜柱低柱壓、 高柱效的優(yōu)勢，適當(dāng)降低了流速，縮短了梯度時間和平衡時間。 不同沙坦類藥物在反相色譜體系中保留能力不同。因此，本文分 別對纈沙坦和厄貝沙坦進行了測試，兩者在常規(guī) C18 色譜柱上可 以分離。而氯沙坦鉀保留相對較弱，需要采用 PFP 色譜柱以改善 API 的保留特性，確保分子量較大的 NDBA 獲得理想的回收率。 洗脫梯度起始采用高比例水相，需要注意復(fù)溶樣品的有機相不宜 過高，否則會影響分子量較小的 NDMA 的峰形和靈敏度。梯度后 半段采用高比例有機相洗脫沙坦類 API。由于 API 濃度很高，為 避免污染質(zhì)譜系統(tǒng)，建議此時將流路設(shè)置為“引入廢液”。 在本文中所用的色譜條件下，6 種亞硝胺之間及雜質(zhì)與 API 之間 分離度良好，典型的 TIC 色譜圖如圖 2 所示。因為受限制的 N-N 鍵存在順反結(jié)構(gòu) (syn and anti conformers)[5]，NMBA 和 NEIPA 在 色譜體系中表現(xiàn)為雙峰，在定量分析時，需要對兩個峰積分并合 并峰面積[1]。 ×104 +TTC MRM (** -> **

結(jié)論： 根據(jù) FDA 的報告，沙坦類藥物中含有或可能含有 6 種亞硝胺類 基因毒性雜質(zhì)，即 NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA。本文采用配備 APCI 源的 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系 統(tǒng)，同時檢測上述 6 種亞硝胺類化合物，方法簡單、特異性高、 重現(xiàn)性好，靈敏度滿足目前 FDA 規(guī)定的*。實驗中測試了 不同的沙坦基質(zhì)，采用適合的色譜柱和色譜方法，可以很好地滿 足靈敏度和回收率要求。另外，通過將方法設(shè)置為將高濃度藥品 基質(zhì)引入廢液而不引入離子源，可減少對質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。該方 法適用于對沙坦類原料藥和部分制劑中的 6 種亞硝胺類基因毒性 雜質(zhì)進行快速篩查和準(zhǔn)確的定量分析。