MS/MS操作模式

    串聯(lián)質(zhì)譜儀通常使用的都是離子模式來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。目前所有的MS/MS質(zhì)譜儀都具有該功能。不過(guò)其它特殊的質(zhì)譜儀也具有MS/MS功能。如果要發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的某個(gè)功能基團(tuán)則需要用到母離子掃描功能或者中性丟失掃描功能，而這就必須用到三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，如Q-Q-Q質(zhì)譜儀，或四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜儀，如Q-Q-LIT質(zhì)譜儀。比如復(fù)雜混合物里的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)就都可以用這種方法（在碰撞池中產(chǎn)生特殊的報(bào)告離子，通過(guò)它來(lái)進(jìn)行特殊的功能檢測(cè)）檢測(cè)出來(lái)。在一個(gè)典型的質(zhì)譜檢測(cè)試驗(yàn)中，首先先用母離子掃描或中性丟失掃描都能發(fā)現(xiàn)目標(biāo)組分，然后再用傳統(tǒng)的MS/MS方法鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及定位修飾位點(diǎn)。

    三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀在MRM模式下也能以*的敏感度進(jìn)行定量分析。已知的或未知的分析物都以*的敏感度和選擇性能被定量檢測(cè)出來(lái)。這種高選擇性得益于質(zhì)譜儀能夠?qū)Υ硪粋€(gè)肽段的一對(duì)母離子和片段裂解物離子進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。而且，在MRM模式下進(jìn)行的兩輪選擇過(guò)程會(huì)極大地提高檢測(cè)的靈敏度，因?yàn)榈冖佥喓Y選過(guò)后只能剩下很少的離子，這也就將背景噪聲減小到了zui低水平。碰撞誘導(dǎo)解離片段離子（collision-induced dissociation fragment ions, CID）來(lái)源于母離子，這些CID離子能夠產(chǎn)生離散信號(hào)，而背景化學(xué)噪聲信號(hào)則是隨機(jī)分布的。zui后，由于這種采樣時(shí)間很長(zhǎng)的技術(shù)固有的非掃描本質(zhì)使得它的敏感度非常高，相比離子掃描技術(shù)的探測(cè)極限（LOD）要高出好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

質(zhì)譜儀的性能

    總體來(lái)說(shuō)，質(zhì)譜儀的性能包括分辨率、敏感度或探測(cè)極限和準(zhǔn)確性等，這些性能都與質(zhì)譜儀的類型、采用的離子化方法和掃描能力有關(guān)。不過(guò)沒有哪一個(gè)儀器能同時(shí)在上述所有方面都全面占優(yōu)，在選擇儀器的時(shí)候必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行相應(yīng)的取舍。

    對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器性能的比較一直以來(lái)都是一個(gè)存在很多爭(zhēng)議的話題。因?yàn)樾阅苁欠?wù)于需求的，是取決于待測(cè)樣品和實(shí)驗(yàn)步驟的。質(zhì)譜儀對(duì)單獨(dú)肽段樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)敏感度總是很低，不過(guò)如果生物樣品的基質(zhì)背景（matrix background）很高，那么檢測(cè)的敏感度就會(huì)提高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這種同一款儀器在性能上表現(xiàn)出來(lái)的“不穩(wěn)定性”其實(shí)很常見，在儀器處于不同操作條件或狀態(tài)下時(shí)（比如在*條件下，常規(guī)條件下和大批量處理?xiàng)l件下）它們的性能表現(xiàn)都是不同的。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窍脒M(jìn)行定量分析還是蛋白質(zhì)鑒定，這也決定了該使用哪種儀器。在蛋白質(zhì)鑒定試驗(yàn)中，儀器的分辨率（能很好地區(qū)分不同組分）和準(zhǔn)確性是zui主要的，而在定量研究中，敏感度、動(dòng)態(tài)范圍和MRM能力才是zui主要的。因此，我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰约皩?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排來(lái)確定該使用哪種質(zhì)譜儀。

    要想用全掃描模式（full scanmode）獲取定量數(shù)據(jù)的同時(shí)再用MS/MS模式獲取定性數(shù)據(jù)是一件非常困難的事情。不過(guò)某些“雜交”質(zhì)譜儀，比如LIT-ICR質(zhì)譜儀，由于它們能夠平行采集數(shù)據(jù)，因此可以部分解決上面那個(gè)問(wèn)題。精確的定量分析需要源自整個(gè)洗脫圖（entire elution profile）的高質(zhì)量的、高信噪比的數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)質(zhì)量與數(shù)據(jù)采集參數(shù)高度相關(guān)，這些數(shù)據(jù)采集參數(shù)包括掃描時(shí)間或者采樣時(shí)間（對(duì)于非掃描質(zhì)譜儀而言）。因此，我們經(jīng)常需要在數(shù)據(jù)質(zhì)量和樣品處理能力（量）之間做出取舍。

zui新進(jìn)展

    zui近又有幾項(xiàng)有關(guān)質(zhì)譜儀的進(jìn)展問(wèn)世，這些新成果的出現(xiàn)又給我們的生物大分子研究工作補(bǔ)充了“彈藥”。在蛋白質(zhì)測(cè)序方面，基于碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)（CID），又新出現(xiàn)了可變裂解技術(shù)（Alternate fragmentationtechnique），該新技術(shù)是基于處在碰撞池中的離子具有的電子傳遞特性開發(fā)出來(lái)的。目前，電子捕獲解離技術(shù)（ECD）和電子傳遞解離技術(shù)（ETD）都已經(jīng)分別被應(yīng)用到FT-ICR質(zhì)譜儀和LIT質(zhì)譜儀上了。運(yùn)用這兩種技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物能與經(jīng)典的CID方法裂解產(chǎn)物互為補(bǔ)充。不過(guò)這兩種新方法裂解更均勻，更適合用于發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾情況。ECD技術(shù)和ETD技術(shù)還都可以用于大型肽段和蛋白質(zhì)的研究。他們的裂解能力和對(duì)完整蛋白的分析能力可以幫助我們直接用質(zhì)譜儀對(duì)完整的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，即可以采用所謂的“自上而下（top-down）”的方法進(jìn)行研究。這樣，我們能夠獲得完整的氨基酸序列信息和翻譯后修飾信息，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行zui準(zhǔn)確的鑒定。

傳統(tǒng)的和的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略

    雖然到目前為止，還沒有一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略能夠?qū)δ硞€(gè)蛋白質(zhì)組進(jìn)行常規(guī)的、完整的分析，但是現(xiàn)在的技術(shù)已經(jīng)非常強(qiáng)大，我們相信，很快就能進(jìn)行全蛋白質(zhì)組學(xué)研究了。而且，對(duì)某個(gè)亞蛋白質(zhì)組（比如某個(gè)細(xì)胞器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組）進(jìn)行研究早就已經(jīng)不是什么難題了，這已經(jīng)成為了一種常規(guī)的研究手段。不過(guò)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法也需要視研究目的而做出相應(yīng)的調(diào)整，不能千篇一律。比如有很多研究都是描述性的研究項(xiàng)目，主要的關(guān)注點(diǎn)都著眼在發(fā)現(xiàn)、鑒定出蛋白質(zhì)以及這些蛋白質(zhì)的翻譯后修飾情況，而zui近又開始逐漸興起蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究了。

    實(shí)際上，每一個(gè)以質(zhì)譜檢測(cè)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作都包括以下3大部分：(i)分離、消化蛋白質(zhì)樣品，然后對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步裂解；(ii)對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜定性和定量檢測(cè)；(iii)用相應(yīng)的軟件對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析處理，獲得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且如果可能的話，進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)的鑒定工作主要由MS/MS質(zhì)譜儀負(fù)責(zé)，然后通過(guò)將質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，zui后確定出蛋白質(zhì)的氨基酸序列。需要提醒的是，對(duì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析工作是保證結(jié)果正確性的關(guān)鍵。

對(duì)純化蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析

    下面，我們用zui“古老”的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法——2維凝膠電泳法（two-dimensional gel electrophoresis, 2DE）結(jié)合質(zhì)譜分析法對(duì)純化蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析的策略為例進(jìn)行介紹（圖2A）。首先，待測(cè)目標(biāo)蛋白經(jīng)消化、酶解之后經(jīng)由質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，通常使用的都是MALDI-ToF質(zhì)譜儀來(lái)獲取肽鏈指紋圖譜（peptide mass fingerprint）。zui近，出現(xiàn)了好幾種該策略的改進(jìn)方法，即將各種連續(xù)電泳分離方法（sequential electrophoretic separation method）或色譜分離方法（chromatographic separation method）結(jié)合進(jìn)來(lái)，以提高質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的峰容量，這樣就提高了對(duì)復(fù)雜樣品的分辨率。定量分析則是在蛋白質(zhì)水平通過(guò)比較不同樣品中目標(biāo)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)完成的。這種策略的優(yōu)劣取決于它們區(qū)分相關(guān)（近）蛋白質(zhì)的能力，即分辨率的高低，比如要能夠區(qū)分出經(jīng)不同類型修飾的蛋白質(zhì)，還取決于待測(cè)樣品的復(fù)雜程度。這種研究策略zui大的問(wèn)題是動(dòng)態(tài)范圍太窄，而且處理樣品的能力也不夠高，不具備高通量分析的功能，因此不足以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。而且，一些比較重要的蛋白質(zhì)，比如膜蛋白等還不能用該方法進(jìn)行分析，因?yàn)樵摲椒ㄖ荒苡糜诜治鰪?fù)雜度比較低的樣品，或者用于對(duì)某一特定蛋白進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)。

對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)

    對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)也用到了人類基因組研究項(xiàng)目中用到的“niao槍法”策略。即首先將蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行裂解，這樣獲得的多肽片段才能夠用于自動(dòng)化MS/MS分析，我們常用的是快速掃描設(shè)備如IT質(zhì)譜儀（圖2B）。用這種方法可以對(duì)完整細(xì)胞裂解物或組織提取物進(jìn)行分析，也可以對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、提純的細(xì)胞器或其它亞蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行檢測(cè)。

    如果給待測(cè)樣品帶上穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，我們就可以對(duì)樣品中不同蛋白質(zhì)的豐度進(jìn)行檢測(cè)了，這些蛋白質(zhì)可能在化學(xué)性質(zhì)方面是一樣的，但是我們可以通過(guò)不同的同位素信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分（圖3A）。也可以使用如圖3B中所示的串聯(lián)標(biāo)記（tandem mass tag）方法對(duì)樣品進(jìn)行多次質(zhì)譜分析。還可以在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前往待測(cè)樣品中添加定量的同位素標(biāo)記肽段，以獲得樣品準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)（圖3C）。

    這種“niao槍法”zui大的優(yōu)勢(shì)就是簡(jiǎn)單，不論從理論層面來(lái)說(shuō)還是從實(shí)驗(yàn)操作層面來(lái)說(shuō)都很簡(jiǎn)單，該方法相比前面所述的各種方法能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)組分進(jìn)行更大程度的覆蓋，同時(shí)定量的準(zhǔn)確性更高。不過(guò)該方法也有其局限性，具體表現(xiàn)在動(dòng)態(tài)范圍不夠，難以使用生物信息學(xué)方法從大量的、高冗余的、復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)中推斷出蛋白質(zhì)序列。幸好這些問(wèn)題已經(jīng)部分得到了解決，通過(guò)裂解的方法可以降低樣品的復(fù)雜程度。常用的裂解方法主要針對(duì)的都是蛋白質(zhì)組中生物信息學(xué)資料豐富的部分，比如富含半胱氨酸的肽段、磷酸化的肽段、糖基化的肽段等等。這種“niao槍法”策略用于快速鑒定復(fù)雜樣品中的組分，也非常適合用于對(duì)不同樣品中同一蛋白質(zhì)的定量比較研究。在“niao槍法”策略中，在蛋白質(zhì)水解過(guò)程里，不同肽段間的聯(lián)系信息以及肽段與其來(lái)源蛋白質(zhì)間的聯(lián)系信息都已經(jīng)丟失了，因此該方法不太適合用于對(duì)具有多重修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定工作。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略示意圖

Protein(s)：待測(cè)蛋白質(zhì)樣品；Enz. Digestion：酶解；Pep.Mixture：裂解產(chǎn)物混合物；

MS Analysis：質(zhì)譜檢測(cè)分析；DB Search：數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)搜索；Identities：鑒定；

Prot.DB ：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；Proteome：蛋白質(zhì)組；Sample prep：樣品準(zhǔn)備（裂解）；

LC/MS& MS/MS：LC/MS以及 MS/MS分析；Quantification：定量研究；

Abundances：豐度；List of targets：挑選出待測(cè)樣品；Pep.lib：待測(cè)靶樣品；

圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略示意圖。A：經(jīng)由2維電泳或pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品prot隨即被酶解，然后用質(zhì)譜儀對(duì)酶解片段pep進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。zui后根據(jù)肽質(zhì)指紋圖譜（PMF）鑒定出肽段以及它們的來(lái)源蛋白。其它的MS/MS數(shù)據(jù)也能用來(lái)進(jìn)行肽段鑒定。B：隨機(jī)蛋白質(zhì)鑒定和定量分析方法，即niao槍法。該方法可以對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行鑒定以及定量研究。被選出的肽段如圖1A中所示，經(jīng)過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行離子掃描分析。在這里，母離子是被隨機(jī)選出的，通常母離子的裂解片段中只有一個(gè)片段能夠被檢測(cè)到，也就是說(shuō)存在采樣不足的問(wèn)題。MS1質(zhì)譜儀采集到的離子強(qiáng)度信息與參考分子信息比對(duì)可以進(jìn)行定量分析，這里使用的參考分子通常都會(huì)標(biāo)記上穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽。C：定量研究方法能去除蛋白質(zhì)定量研究與鑒定過(guò)程中的干擾信號(hào)。首先，MS1質(zhì)譜儀會(huì)通過(guò)比對(duì)不同樣品的肽模式，即肽段分子量相對(duì)色譜保留時(shí)間作圖的結(jié)果，挑選出不同樣品間豐度不同的肽段。然后被挑出的肽段進(jìn)入下一輪MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)。D：基于各種假說(shuō)的檢測(cè)方法。該方法可以對(duì)各種預(yù)先被設(shè)定肽段的豐度進(jìn)行高精度的檢測(cè)，我們通常都是根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)挑選這些靶肽段。在這里常用的方法是圖1D中所示的MRM方法。如果在試驗(yàn)中選用合適的參考肽段會(huì)進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

比較模式分析

    圖2C中所示的比較模式分析法其實(shí)在原理上與2維電泳方法是相似的，就像在2維電泳中一樣，每一個(gè)蛋白質(zhì)都是一個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)，可以借此對(duì)它們進(jìn)行定量和定性的分析。而且還可以進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，比如進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序或進(jìn)行翻譯后修飾情況鑒定等。不過(guò)在以質(zhì)譜檢測(cè)手段為基礎(chǔ)的分析方法中，蛋白質(zhì)樣品首先需要被降解、片段化，然后再用液相色譜-質(zhì)譜儀LC/MS進(jìn)行分析。借助色譜洗脫時(shí)間和分子量這兩個(gè)參數(shù)，我們就可以鑒定出一個(gè)多肽離子。將所有離子的數(shù)量信息整合起來(lái)就得到了蛋白質(zhì)的定量信息。這種方法主要的優(yōu)勢(shì)在于它可以對(duì)質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)的所有信息進(jìn)行定量處理。與“niao槍法”相比這是非常明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵?ldquo;niao槍法”里，只能對(duì)被鑒定出來(lái)的肽段進(jìn)行定量化處理。不過(guò)在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，這種比較模式分析方法的重復(fù)性很差，也沒有非常好的配套軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。用這種方法可以獲得一些數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)能夠推測(cè)出蛋白質(zhì)序列，這些數(shù)據(jù)包括質(zhì)荷比（m/z）、帶電荷狀態(tài)、洗脫時(shí)間以及離子強(qiáng)度等。需要被測(cè)序的多肽（比如在兩個(gè)樣品中表達(dá)豐度不同的同一蛋白質(zhì)）會(huì)出現(xiàn)在檢測(cè)結(jié)果列表中，然后，我們會(huì)將該蛋白（多肽）進(jìn)行新一輪的直接質(zhì)譜檢測(cè)，專門只采集它的MS/MS質(zhì)譜圖信息。這種研究方法也可用于MALDI/MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)樣品都被“固定”在樣品板上，因此可以對(duì)它們進(jìn)行不受時(shí)間限制的連續(xù)檢測(cè)。

基于各種假說(shuō)的研究策略

    隨著各種質(zhì)譜儀技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們有理由相信會(huì)出現(xiàn)敏感度更高、處理速度更快、更可靠的蛋白質(zhì)組研究設(shè)備。不過(guò)目前我們還不清楚這些技術(shù)上的進(jìn)步是否足以突破當(dāng)下蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作中的瓶頸。以前我們?cè)J(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略需要進(jìn)行有效的變革才能全面、有力的對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究和分析。這種變革的核心就是改變以往那種在每一次試驗(yàn)中都對(duì)既往結(jié)果進(jìn)行重復(fù)研究的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，新的研究策略是根據(jù)既往的研究成果來(lái)設(shè)計(jì)、指導(dǎo)進(jìn)行新的實(shí)驗(yàn)研究項(xiàng)目。我們預(yù)計(jì)與人類基因組計(jì)劃一樣，將來(lái)也會(huì)獲得某個(gè)物種的完整蛋白質(zhì)組序列圖譜，未來(lái)蛋白質(zhì)組的研究目標(biāo)應(yīng)該是對(duì)蛋白質(zhì)（多肽）進(jìn)行具有特定目的的、非冗余的分析研究。對(duì)于質(zhì)譜技術(shù)和質(zhì)譜儀器的發(fā)展來(lái)說(shuō)，這種研究策略的轉(zhuǎn)變需要有更好的檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)手段（流程）做依托，要能夠以更快的速度、更高的靈敏度和更強(qiáng)大的分析能力進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)?，F(xiàn)在也出現(xiàn)了可供序列組裝、修飾情況查詢的數(shù)據(jù)庫(kù)?？梢灶A(yù)計(jì)，在不久的將來(lái)，各種生物學(xué)假說(shuō)將會(huì)給我們?cè)O(shè)定出許多待檢測(cè)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。我們可以將這些蛋白質(zhì)的信息錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)成一個(gè)檢測(cè)這些假說(shuō)所必需的極小集蛋白質(zhì)信息簇。然后，可以用各種方法，比如MRM方法對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)（圖2D）。因?yàn)檫@種研究方法主要是對(duì)非冗余靶標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，所以，在檢測(cè)的敏感度方面和樣品處理能力方面都有很大的提高。如果再配合定量的、標(biāo)準(zhǔn)化的同位素標(biāo)記參考肽段，還可以進(jìn)行精確的定量分析。

    上述這種研究策略用于Q-Q-LIT質(zhì)譜儀這類被我們使用了幾十年，主要用于檢測(cè)小分子藥品和體內(nèi)藥物代謝研究領(lǐng)域的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀。在研究藥物代謝時(shí)使用的研究方法同樣適用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域。

    作為上述方法的一個(gè)補(bǔ)充，Smith又開發(fā)出另一種使用精確分子量標(biāo)簽來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的方法。該方法首先測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的分子量，然后將數(shù)據(jù)與分子量數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以此來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。這樣就無(wú)需再對(duì)每一個(gè)樣品中的每一條多肽進(jìn)行測(cè)序了。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷開展，我們積累的數(shù)據(jù)也越來(lái)越多，并且數(shù)據(jù)積累的速度也越來(lái)越快，同時(shí)，各種分析軟件的功能也越來(lái)越強(qiáng)大，因此我們相信，基于各種假說(shuō)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略一定會(huì)被更多的人所接受，所采用。

 肽段定量分析策略示意圖

Labeling：標(biāo)記 Tag：標(biāo)記物 Peptide：肽段Mixing：混合 Analysis：分析

MS：質(zhì)譜檢測(cè) light：較輕的片段 heavy：較重的片段 Time：時(shí)間

Tandem mass tag：串聯(lián)標(biāo)簽 MS/MS：MS/MS模式 m/z：質(zhì)荷比

No labeling!：為標(biāo)記 MRM：MRM方法

Internal standards(isotopically labeledpeptides)：內(nèi)參，即同位素標(biāo)記的肽段

圖3 肽段定量分析策略示意圖。A：同位素稀釋法是進(jìn)行肽段定量分析時(shí)zui常用的一種方法，該方法也是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)常用的一個(gè)方法。該方法的原理是在一號(hào)樣品所有的待測(cè)蛋白質(zhì)上都帶上一個(gè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽，同時(shí)在二號(hào)樣品所有的待測(cè)蛋白質(zhì)上都帶上另一個(gè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽。這樣，這兩組樣品就可以互為參照了?？梢越柚瘜W(xué)的方法，例如穩(wěn)定的同位素編碼標(biāo)簽試劑、代謝標(biāo)記反應(yīng)和酶標(biāo)反應(yīng)等對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行同位素標(biāo)記。B：使用串聯(lián)標(biāo)簽進(jìn)行定量研究。該方法同樣需要各種穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物。這些同位素標(biāo)記物由兩種同位素標(biāo)記元素組成，它們都有固定的分子量。目前，這些試劑可用于四通道反應(yīng)。通過(guò)在質(zhì)譜儀的MS/MS模式下檢測(cè)連接在蛋白質(zhì)N端報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)強(qiáng)度以及CID圖譜中低分子量范圍里的信號(hào)可以獲得待測(cè)蛋白質(zhì)的定量信息。C：使用內(nèi)參進(jìn)行定量研究的方法。該方法實(shí)際上也是一種同位素稀釋法。在該方法中會(huì)往待測(cè)樣品中添加一種已知濃度的同位素標(biāo)記的肽段，然后借助標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行精確的定量分析。雖然該方法樣品制備過(guò)程較為復(fù)雜，但是它的前景非常光明。它非常適合用于基于各種假說(shuō)的檢測(cè)方法。

結(jié)論與展望

    在過(guò)去的十年里，是蛋白質(zhì)分析，更準(zhǔn)確的說(shuō)應(yīng)該是蛋白質(zhì)組學(xué)分析推動(dòng)了質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。各種技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)使質(zhì)譜儀在準(zhǔn)確度、分辨力、敏感度、定量分析能力等各方面都有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，蛋白質(zhì)組質(zhì)譜檢測(cè)策略方面也有了新突破。分析完整蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體、低豐度蛋白質(zhì)等各種樣品的檢測(cè)操作流程層出不窮。雖然這些質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)是為了滿足蛋白質(zhì)分析的需求而誕生的，但是它們出現(xiàn)之后又反過(guò)來(lái)推動(dòng)了生物大分子（包括代謝產(chǎn)物、脂類物質(zhì)、碳水化合物等等）領(lǐng)域的研究。因此，我們有理由相信，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)必將在生物研究的各個(gè)領(lǐng)域里占有重要的一席之地。

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