引言：中國(guó)長(zhǎng)期使用中藥和中藥制劑，對(duì)其治療作用有豐富的經(jīng)驗(yàn)。但質(zhì)量控制僅局限在外觀檢查是不夠的。隨著新技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些中藥中有幾百種化合物，其濃度范圍很寬。而且，產(chǎn)地不同和采摘時(shí)期不同，以及炮制和加工工藝不同，中草藥的成分也不同。因此，對(duì)中藥化合物的質(zhì)量控制挑戰(zhàn)性?，F(xiàn)在，只測(cè)定中藥制劑中一個(gè)或兩個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制已經(jīng)不夠了，因?yàn)樘厥馀浞降闹兴幹苿┒际怯梢环N以上中藥組成的。例如，芪參益氣滴丸，一種用于治療冠心病的中成藥，包含4種中藥：黃芪、丹參、三七、降香

本研究以芪參益氣滴丸為樣品，用高分離度快速液相色譜（RRLC）-紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器和質(zhì)譜聯(lián)用，建立中藥質(zhì)量控制的新方法。主要目標(biāo)是建立一種可靠的方法，能夠選測(cè)定在加熱和混合過(guò)程中不變的潛在目標(biāo)化合物。

實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1200系列RRLC系統(tǒng)包括：帶真空脫氣機(jī)的SL 型二元泵、SL型高性能自動(dòng)進(jìn)樣器、配置微量流通池(2 μL體積，3 mm光程)的SL型柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器SL，

Agilent 6410四極桿質(zhì)譜儀，配置ESI離子源

Agilent 化學(xué)工作站B.02.01 SR1，用于數(shù)據(jù)采集和分析

Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，3.0 x 50 mm, 1.8 μm粒徑

標(biāo)準(zhǔn)品

丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參素、三七皂甙R1和黃芪甲苷均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、原兒茶醛、原兒茶酸、人參皂甙Re和人參皂甙Rc 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司（美國(guó)）。

溶劑

乙腈購(gòu)自Fisher 公司（美國(guó)），水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

樣品和樣品制備

芪參益氣滴丸、黃芪、丹參、三七的中間提取物，及降香精油，由中國(guó)TASLY制藥公司提供。原藥材購(gòu)自當(dāng)?shù)刂兴幍辍?/span>

滴丸、中藥提取物和中藥原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超聲提取30分鐘，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

RRLC方法

流動(dòng)相：

A: 0.1 %甲酸水

B: 乙腈，含0.1 %甲酸

梯度：0分鐘，10 %B；8分鐘，38 %B；12分鐘，100 %B；持續(xù)3分鐘，然后10 %B

流速： 1.0 mL/min（ 被動(dòng)分流器將進(jìn)入M S 的流速降至0.4 mL/min）

柱溫：45 °C

檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm

峰寬：0.5 s

狹縫寬度：4 nm

光譜：190-400 nm，2 nm步進(jìn)

標(biāo)準(zhǔn)品

丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參素、三七皂甙R1和黃芪甲苷均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、原兒茶醛、原兒茶酸、人參皂甙Re和人參皂甙Rc 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司（美國(guó)）。

溶劑

乙腈購(gòu)自Fisher 公司（美國(guó)），水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

樣品和樣品制備

芪參益氣滴丸、黃芪、丹參、三七的中間提取物，及降香精油，由中國(guó)TASLY制藥公司提供。原藥材購(gòu)自當(dāng)?shù)刂兴幍辍?/span>

滴丸、中藥提取物和中藥原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超聲提取30分鐘，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

RRLC方法

流動(dòng)相：

A: 0.1 %甲酸水

B: 乙腈，含0.1 %甲酸

梯度：0分鐘，10 %B；8分鐘，38 %B；12分鐘，100 %B；持續(xù)3分鐘，然后10 %B

流速： 1.0 mL/min（ 被動(dòng)分流器將進(jìn)入M S 的流速降至0.4 mL/min）

柱溫：45 °C

檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm

峰寬：0.5 s

狹縫寬度：4 nm

光譜：190-400 nm，2 nm步進(jìn)

質(zhì)譜方法

掃描：80-1400（正/負(fù)）

碰撞誘導(dǎo)解離電壓：70（正/負(fù)）

干燥氣體：12 L/min

霧化器壓力：50 psi

干燥氣溫度：50 °C

毛細(xì)管電壓：3200 V（正/負(fù)）

結(jié)果與討論

用安捷倫方法轉(zhuǎn)換計(jì)算器（光盤(pán)發(fā)行號(hào)5989-5130EN）將常規(guī)液相色譜方法轉(zhuǎn)換成高分離度快速液相色譜方法。

丹參三七黃芪和降香提取物的比較

由圖1可見(jiàn)，在203 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，丹參和三七的色譜圖與混合提取物有很大區(qū)別?；旌虾图訜岷螅承┓逑Я?，同時(shí)出現(xiàn)了一些新的色譜峰。

目標(biāo)化合物篩選是質(zhì)量控制的重要步驟，可以確定加工過(guò)程中這些化合物是否發(fā)生了變化。大多數(shù)研究者都用203 nm進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)橹饕钚曰衔锸窃磉?，?/span>203 nm波長(zhǎng)下有弱吸收。但203 nm處的大峰可能與質(zhì)量控制無(wú)關(guān)，那些小峰可能對(duì)研究活性成分更重要。因此，需要另一種靈敏度更高的檢測(cè)器，提供這些成分的更多信息。

不同檢測(cè)器和條件之間的比較

圖2 顯示了紫外和MS檢測(cè)的不同結(jié)果。在MS的總離子色譜圖中有更多的峰，因?yàn)槟承┏煞肿贤馕蘸苋趸蛘邲](méi)有吸收。用MS檢測(cè)增加了另一維數(shù)據(jù)，并得到了這些不同化合物的結(jié)構(gòu)信息。負(fù)離子模式給出了這些峰更完整的信息，可以對(duì)質(zhì)量控制的目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒定。

芪參益氣滴丸和不同提取物之間的比較

圖3 顯示了丹參、黃芪和降香提取物與芪參益氣滴丸（由這三種提取物和其它填加劑制成）的色譜圖。標(biāo)記數(shù)字的峰就是對(duì)這一中藥制劑質(zhì)量控制篩選到的目標(biāo)化合物。根據(jù)UV和MS數(shù)據(jù)，研究不同的色譜峰，以確定這些化合物是否發(fā)生了改變。表1列出了鑒別的結(jié)果。

結(jié)論

本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)的RRLC-紫外和MS檢測(cè)方法比目前藥典控制單一組分的質(zhì)量控制方法更可靠，因?yàn)槟軌蚋鶕?jù)UV和MS檢測(cè)器提供的信息跟蹤中藥中幾種成分的質(zhì)量。跟蹤這些成分非常重要，因?yàn)檫@些成分可能在炮制和加工過(guò)程中發(fā)生變化。質(zhì)譜測(cè)定使用的Agilent 6140四極桿質(zhì)譜儀，與Agilent 1200系列RRLC系統(tǒng)和Agilent化學(xué)工作站軟件能夠*集成。